分子生物学检验：第五章 生物芯片技术

1、第五章 生物芯片技术生物芯片概述 早在八十年代初有人就曾设想利用计算机半导体技术生产基因芯片以对人类基因组大量的遗传信息进行分析和检查，但直到光引导原位合成(light-directed in situ synthesis)高密度探针技术和激光共聚焦显微扫描问世之后才使该设想逐步成为现实，并迅速应用到分子生物学的多个领域，得到了科学界的高度重视。生物芯片生物芯片技术是一种高通量检测技术。 通常我们所说的生物芯片是将含不同生物信息的生物分子集成到一块芯片上,用以同时分析多种生物分子的信息。由于常用玻片/硅片作为固相支持物，且在制备过程模拟计算机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片技术。DNA的一些

2、基本概念绝大多数的生物是用DNA做为遗传物质。生物的每个细胞都包含了完整的DNA信息。每个人类细胞包含了30亿个碱基（A，G，C，T）。不同物种的DNA序列都不同，每个生物体之间也有差异。因此，我们可以用DNA检测来鉴定和检测物种和个体。人有多少基因?Fruit fly: 13,000 genesHuman: 28,000 genes.The surprisingly small number of genes in the human genome ( 100,000 expected; 30,000 identified) was a major surprise from the pro

3、ject. Human Beings are 99.99% the same Millions of differences between of us先天愚型也称21三体综合征 (47XX+21) 或Down综合征（唐氏综合征），属常染色体畸变遗传病蓝肤症：蓝色的人，整个十九世纪60年代，一个庞大的“蓝人”家族居住在肯德基州山上，紧挨着克里克联盟的印第安人。An enzyme called “NADH diaphorase,” (辅酶脱氢酶) 。 This enzyme repairs hemoglobin that has been damaged by oxidization. Huma

4、ns in whom this gene is defective cannot make the enzyme, and accumulate damaged hemoglobin, which is blue. As a result, their skin appears blue.什么使他们俩不一样什么使他成这样分子生物学的发展为核酸序列分 析与测定提出的新要求速度快、效率高可同时对大量核酸序列进行检测和分析操作简便、自动化程度更高总体效率较常规杂交方法高一、生物芯片的定义生物芯片是采用类似集成电路制作中的微加工技术，将生命科学研究中的若干不连续过程如样品制备、生化反应、检测和分析等步

5、骤集成到一块几平方厘米大小的芯片上，并使这些分散的过程连续化与微型化，以此来实现对大量生物样品数据的快速、自动和并行处理。生物芯片（biochip）采用原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽等等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。二、生物芯片的特点高通量：可进行样品的多方面分析，提高精确性，减少误差。集成化：降低成本，保证质量。高度并

6、行性：提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读。微型化：减少试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速率。生物芯片根据探针不同分为：DNA芯片，蛋白质芯片，细胞芯片，组织芯片。根据用途不同，可分为：表达分析芯片，测序芯片和芯片实验室根据原理和载体不同，可分为：固相芯片和液相芯片微缩芯片实验室：是生物芯片发展的最终目标，将各种生物化学分析操作的整个过程，从样品制备、生化反应到结果检测，都集成化并缩微到芯片上自动完成，以获得所谓的微型全分析系统生物芯片的应用分子生物学、生物进化（生物起源及新物种鉴定）生物医学（新药的筛选与合成，疾病诊断和治疗，如癌症、早年性痴呆症等的病因研究）农林科学（农作物育

7、种改良、食品卫生监督、微生物检测）环境科学生化武器侦检司法鉴定等第一节 基因芯片一、基因芯片的原理二、基因芯片技术三、基因芯片的应用一、基因芯片的原理原理：将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行基因的分析。基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效、快速的核酸序列分析手段。DNA Microarry 原理: DNA杂交碱基互补杂交是根据碱基互补的原理。探针分子固定于支持物上固定于支持物上的探针, 与标记的样品进行杂交利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。固定于支持物上的探针, 与标记样品的碱基不互补则探针与样品不能进行杂交通过检

8、测杂交信号的强度及分布来进行分析从而得到基因的表达水平 正常 高表达 低表达通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量 。基因芯片技术流程图 基因芯片技术与传统杂交检测方式的比较 基因芯片技术从本质上说与Southern Blotting或Northern Blotting相同（所以Affymetrix曾与Southern就专利问题产生冲突），只是探针密度极高而已。不过，为此花费了大量的人力物力从事研制工作。当然，其结果也很是诱人。基因芯片的基本构造1.支持物：如玻片、硅片、NC膜、Nylon膜2.探针：高密度的探针序列按照一定的次序固定在支持物上，每个位点的序列是已知的外观探针支持物剖

9、面图平面局部放大六、基因芯片相关技术硬件：序列合成设备包括：核酸或多肽合成仪（作预合成点样用）、照相平板印刷及半导体制作相应设备（作光引导原位合成）。激光共聚焦显微扫描设备：激光共聚焦显微镜或相应设备，以采集高密度点阵杂交信号并进行数字化处理分析。软件基因序列分析及探针筛选技术（可能涉及专利等产权问题）序列合成及定位技术（光引导原位合成或微量点样技术）杂交信号的采集和分析技术（需要处理极大量的杂交信号并能由此得到所需信息）二、基因芯片技术基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测以及结果分析。（一）芯片制备 1. 合成探针 探针合成是基因芯片制作的首要步骤。基因组

10、探针：从基因组文库中选择与待测靶序列完全匹配或带有突变 位点的序列，通过PCR技术扩增获得cDNA探针：根据待分析基因表达的mRNA，从cDNA文库中通过PCR技术 扩增获取，扩增片段的选择尽可能靠近cDNA序列的3端， 长度一般在1kb左右寡核苷酸探针：对于较短的寡核苷酸探针，则可以直接应用DNA合成 仪合成2.探针在载体表面的固定（分为两大类）原位合成：在支持物表面原位合成寡核苷酸探针，适用于寡核苷 酸，有原位光刻合成、压电打印法和分子印章原位合 成三种途径合成点样：将预先合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的 高速点样机器人直接点在芯片上的技术，用于大片段 DNA，寡核苷酸，mR

11、NA。 固相载体材料固体片状材料：主要有玻片、硅片和瓷片等；膜性材料 ：有硝酸纤维素膜、尼龙膜以及聚丙烯膜等。基因芯片多采用载玻片或者尼龙膜做载体为使探针能稳定固定在片基表面，需对片基进行化学处理，即活化，主要是涂布多聚赖氨酸或者包被氨基硅烷偶联试剂 原位合成有三种途径：原位光刻合成压电打印法 分子印章原位合成法。 DNA固相合成法DNA固相合成法原位光刻合成原理：首先使支持物羟基化，光敏保护基团将其保护。在合成碱基单体的5羟基末端连上一个光敏保护基。选取适当的蔽光膜 (mask) 使需要聚合的部位透光，受光部位的羟基脱保护而活化。因为合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏

12、保护基的保护，所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基团。每次通过控制透光与不透光决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。 图103原位光刻合成技术的流程图 原位光刻合成优点： 合成效率高，点阵密度高缺点： 设备昂贵，技术复杂，反应产率低压电打印法原理其装置与普通的彩色喷墨打印机并无两样，所用技术也是常规的固相合成方法。将墨盒中的墨汁分别用四种碱基合成试剂替代，支持物经过包被后，通过计算机控制喷墨打印机将特定种类的试剂喷洒到预定的区域上。冲洗、去保护、偶联等则同于一般的固相原位合成技术。如此类推，可以合成出长度为40到50个碱基的探

13、针。 优点： 设备廉价，技术相对简单，反应产率高 缺点： 点阵密度低，易产生交叉污染压电打印原位合成法工作方式 预合成点样技术（Off-chip synthesis) 这一方法在多聚物的设计方面与前者相似，合成工作用传统的DNA或蛋白固相合成仪进行。多聚物合成后再用特殊的点样装置或仪器将其以较高密度分布于硝酸纤维膜或经过特殊处理的玻璃片上，点阵密度可达到2500spots/cm2（Yershov et al报道点阵密度最高可达20,000-30,000spots/cm2）。二、样品的制备样品的制备过程包括：核酸分子的纯化、扩增和标记1样品的分离纯化 主要从活组织或血液中获得DNA或mRNA，这

14、个过程包括细胞分离，破裂，去蛋白，提取及纯化核酸的过程。二、样品的制备2.扩增：测定过程需要较多的样本基因类型分析的样本是DNA （PCR直接扩增）基因表达研究的样本是cDNA （RT-PCR制备）3. 标记：样本制备后应进行标记，通常为酶标记、荧光标记和核素标记。带有标记的dNTP（cy3或cy5-dNTP、32P-dNTP、生物素-dNTP）通过DNA或cDNA扩增的过程，掺入靶分子序列。也可以在制备引物时，掺入标记的核苷酸，扩增靶序列后，使扩增产物末端带有标记物。 样品分子标记的质量影响芯片检测的灵敏度，因此，核酸的提取，反转录以及标记等各环节要求严格操作。荧光标记分辨率高于同位素标记，

15、没有同位素标记的限制，而且可以采用双色，如对照样品标红色，待检样品标绿色，有助于结果分析与判断，因此被广泛应用于基因芯片样品的标记。（三）杂交反应杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行反应,产生一系列信息的过程，是芯片技术中除芯片制备外最重要的一步。原理：液相中探针与DNA片段按碱基配对规则形成双链反应 芯片杂交反应的条件依据探针长度、类型以及不同的目的，确定温度、盐浓度与反应时间。通常采用的条件是：42，50%甲酰胺，6SSC，0.5%SDS，5Denhardt试剂。也可采用65，6SSC，0.5%SDS，5Denhardt试剂或者65，10%SDS，7%PEG-800。 杂交过程类似N

16、orthern或Southern杂交，如封闭液预杂交、杂交、清洗、干燥与检测。选择合适的反应条件能减少生物分子之间的错配率。选择杂交条件时，必须满足检测时的灵敏度和特异性。使能检测到低丰度基因，且能保证每条探针都能与互补模板杂交。温度、非特异性本底等均会影响杂交结果 最好在封闭循环条件下杂交（四）信号检测和分析杂交信号的检测方法很多，如荧光显影法、质谱法、化学发光和光导纤维等，其中使用最广泛的是荧光显影法。荧光检测法的主要过程主要过程：荧光素标记扩增过的靶序列或样品，与芯片上的探针杂交，洗去未杂交分子，荧光显微镜对片基进行扫描，采集每点荧光强度并分析比较。正常的碱基配对双链比错配双链分子具有较

17、高的稳定性，探针与样品完全配对时产生的荧光信号强度更强，且荧光信号的强度还与样品中靶分子的含量呈一定的线性关系。因此精确测定荧光信号强度就可反映杂交反应的特异性和强弱。分析检测荧光强度的主要手段：激光共聚焦显微扫描技术和电荷偶联装置照相机(charged-coupled device camera, CCD) （四）显色和分析测定方法荧光法：重复性好，但灵敏度较低。（正常配对与错配均能发出阳性信号）多色荧光技术：提高基因芯片检测的准确性和测量范围。（把不同来源的靶基因用不同激发波长的荧光物来修饰）光纤DNA生物传感器微阵列(fiber-optic DNA biosensor microarra

18、y)：（将生物传感器与微阵列的优势结合在一起的方法）操作分析过程非常快速，5min内即可完成，且不需要激光共聚焦显微镜。 基因芯片研制的总体蓝图 研制方向的确定基因组序列分析与待检基因探针序列的确定检测样品 的制备探针阵列的准备检测设备的研制杂交检测与数据分析基因芯片的应用Kary B. Mullis, PhDNobel Prize 1993polymerase chain reaction (PCR)聚合酶链式反应 DNA 扩增DNA 扩增RT-PCR 测定基因表达水平 RNAControlCellsTreatedCells RNA测数个基因PCRElectrophoresiscDNAVEG

19、F实时PCR (Real Time PCR) 测数十个基因 正常 高表达 低表达基因芯片同时检测数千基因的表达。三、基因芯片的应用1. 寻找和发现新基因将cDNA文库的克隆扩增，以点阵形式排列在载体上，用特定的寡核苷酸探针系统与其杂交，对杂交信号进行分析即可快速地对文库中代表不同基因的cDNA克隆予以鉴定和分类。通过相应的公式计算出克隆的相似系数，并进行比较，不但可以得到各基因的表达丰度，而且可以发现新的基因。 三、基因芯片的应用2. 基因表达分析 对基因功能的研究将大量的功能基因制成表达谱芯片，用不同的荧光染料标记不同组织或细胞的mRNA与芯片上的基因杂交、扫描，可得到基因在不同组织或细胞的

20、表达谱。再通过计算机分析这些基因在不同组织中表达的差异，可直接快速地同时监测成千上万的基因，这是进行基因功能研究的重要而高效的手段。2、基因表达分析三、基因芯片的应用3. DNA序列测定与序列间比较（1）DNA序列测定 杂交测序技术(sequencing by hybridization, SBH)邻堆杂交技术(contiguous stacking hybridization, CSH)原理:将未知序列的靶DNA与大量含不同序列的寡核苷酸集合杂交形成完整的双链体，根据碱基配对的原理确定其互补的靶核酸序列。对杂交部位进行鉴定和分析并经计算机分析处理，拼接出正确的靶DNA序列。DNA测序。如使用

21、美国Affymetrix公司1998年生产出的带有13.5万个基因探针的芯片就可以使人类DNA解码速度提高了25倍。三、基因芯片的应用（2）序列比较研究 在遗传分析和基因组分析中，常常需要进行大规模的序列比较，确定序列之间的相似性。原理：一特定DNA在芯片上的杂交特征可与一已知序列的DNA片段相比较，一个最高得分的特定DNA清单(LIST)与已知序列的清单比较用来判断其相似性。序列分析可加快人们对于不同物种的相关序列的比较研究，可用于人类基因组多样性和进化研究计划。三、基因芯片的应用4. 突变体和多态性的检测利用结合在玻璃支持物上的等位基因特异性寡核苷酸(ASOs)微阵列建立了简单快速的基因多

22、态性分析方法。（apo(a)(TTTTA)n） 5. 在疾病诊断的应用（1）感染性疾病的诊断 性传播疾病、肝炎等。（2）遗传性疾病的诊断 地中海贫血、婚前检查等。（3）耐药性检测 结核分支杆菌耐药性检测芯片等。5、疾病诊断其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。基因表达水平的异常可引起疾病肿瘤细胞多种致癌基因表达升高肿瘤细胞多种肿瘤抑制基因表达降低常染色体显性遗传性多囊肾 Polycystic Kidney Disease PKD1 和 PKD2 先天异常多在40岁以后发病半数出现肾衰遗传病 迟发型基因突变癌症抑制基因BRCA1 和 BRCA2 突

23、变可引起乳腺癌检测BRCA1 和 BRCA2 突变及早发现乳腺癌癌症有多基因突变突变的基因P53P19p16子宫内膜癌的基因表达上调的基因。子宫内膜癌的基因表达下调的基因。Which treatment?What are my chances?Which class ofcancer?Is it benign?基因在癌症研究中的应用 Understanding Cancer治疗TherapeuticChoice预后Prognosis诊断Diagnosis分类Classification 6、药物筛选和新药开发 由于所有药物都是直接或间接地通过修饰、改变人类基因的表达及表达产物的功能而生效，而芯

24、片技术具有高通量、大规模、平行性地分析基因表达或蛋白质状况的能力，在药物筛选方面具有巨大的优势。其优点为：在进入临床试验前，药物基因组学可以通过化合物对基因多态性的影响挑选先导物，从而降低由于药效的不稳定导致的失败几率。在期临床试验中，个体基因型可以预见基因多态性造成的药物代谢动力学差异。由于药物作用靶蛋白的差异反映在基因多态性上，因此在期临床试验中，由个体基因型可以预见基因多态性造成的药效差异，由此来指导期临床试验。 一旦发现一种可以导致药物作用差异的蛋白，其他与之相关的蛋白可作为潜在的药物作用靶。 7、环境保护 在环境保护上，基因芯片可以快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的

25、污染和危害，同时也能够通过大规模的筛选寻找保护基因，制备防治危害的基因工程药品、或能够治理污染源的基因产品。8、司法 通过DNA指纹对比来鉴定罪犯，未来可以建立全国甚至全世界的DNA指纹库，到那时以直接在犯罪现场对可能是疑犯留下来的头发、唾液、血液、精液等进行分析，并立刻与DNA罪犯指纹库系统存储的DNA“指纹”进行比较，以尽快、准确的破案。9、现代农业 基因芯片技术可以用来筛选农作物的基因突变，并寻找高产量、抗病虫、抗干旱、抗冷冻的相关基因，也可以用于基因扫描及基因文库作图、商品检验检疫等领域。10. 指导个体化用药Individualized Chemotherapy种族、个体等因素都会导

26、致遗传背景的差异，临床上，同样剂量的药物对于不同患者在药物疗效与副作用方面会有很大差异，如果利用基因芯片技术对患者进行诊断再开处方，就可以对患者实施个体化治疗。疾病一般不是由单个基因引起的， 在治疗中很多同种疾病的具体病因是因人而异的，所以用药也因人而异。 第三节 蛋白芯片一、蛋白芯片的原理与分类二、蛋白质芯片制作和检测的基本流程三、蛋白质芯片的应用 蛋白质芯片（protein chip），又称蛋白质微阵列(protein microarray)，是用于蛋白质功能研究及相互作用分析的生物芯片，采用原位合成、机械点样或共价结合的等方法将多肽、蛋白、酶、抗原、抗体固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝胶、

27、尼龙膜等固相介质上形成的生物分子点阵。 2、蛋白质芯片原理蛋白芯片是指将大量蛋白质分子(蛋白质组) 按预先设置的排列固定于一种载体表面行成微阵列，然后与要检测的组织或细胞等进行“杂交”，再通过自动化仪器分析得出结果。这里所指的“杂交”是指蛋白与蛋白之间如(抗体与抗原)在空间构象上能特异性的相互识别。蛋白质组(proteome)是指一个基因，一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分。蛋白质组学研究的是在不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体，从而揭示和说明生命活动的基本规律。生物活性的蛋白质的产生生物活性的蛋白质加工、修饰基因的转录 表达 蛋白质前体蛋白质组(proteome)是指一个基因，一个细胞

28、或组织所表达的全部蛋白质成分。蛋白质组学研究的是在不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体，从而揭示和说明生命活动的基本规律。蛋白质组学可以分为三个领域:蛋白质的大规模的分离与鉴定，以及它们的表达后修饰; 蛋白水平的差异显示在疾病中的运用; 运用当前的一切手段研究蛋白质与蛋白质之间的相互关系。 蛋白质组与基因组的相比:对一个机体而言，基因的数目是恒定的，而蛋白质的种类和数目在同一个机体的不同细胞中各不相同，即使同一细胞在不同的时期，不同条件下，其蛋白质表达也不同。mRNA水平(包括mRNA的种类和含量)并不能完全反映出蛋白质的表达。另外从研究手段方面来说，蛋白质研究技术比基因技术相对要复杂和困难

29、，不仅氨基酸残基数量多于核甘酸残基，而且在蛋白质组研究中没有一种方法象PCR那样能迅速扩增目的片段，这样对于那些含量很低但对细胞功能起重要作用的蛋白质很难进行大规模的研究。 2蛋白质芯片的特点: 蛋白质芯片是一种高通量的研究方法，能在一次实验中提供相当大的信息量，使我们能够全面、准确的研究蛋白表达谱。蛋白质组芯片的灵敏度高，它可以检测出蛋白样品中微量蛋白的存在，检测水平已达ng级。蛋白质芯片具有高度的准确性。 蛋白质芯片的分类按工作原理分为探针型和凝胶电泳型芯片探针型类似于DNA芯片，即在固相支持物表面高密度排列的探针蛋白质点阵，可特异捕获样品中的靶蛋白，然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分

30、析。微型化凝胶电泳板：在电场作用下，样品中的蛋白质通过芯片上的孔道分离开来，经喷雾直接进入质谱仪进行检测，以确定样品中蛋白质的分子量及种类。蛋白质芯片的分类按点样蛋白质有无活性功能分为无活性和有活性的芯片。无活性的芯片是将已经合成好的蛋白质点在芯片上有活性的芯片则是指点在芯片上的样品是活的生物体（如细菌），在芯片上原位表达蛋白质。活性芯片可以提供模拟的机体内环境，对于分析蛋白质功能有利。蛋白质芯片的分类按作用分为蛋白质表达芯片(Protein expression chip, PEC) 和蛋白质功能芯片(Protein function chip, PFC)PEC能通过观察在不同条件下蛋白质表

31、达以及表达的水平而获得此基因表达的详细信息而PFC则能分析众多蛋白质的性质蛋白质芯片的分类按样品结合方式分为化学型和生物化学型。化学型蛋白质芯片是通过介质的疏水力、静电力、共价键等，利用反相层析、离子交换层析、金属螯合层析等结合样品中的蛋白质，然后经特定的洗脱液除去杂质蛋白质，而保留感兴趣的蛋白质，这种芯片特异性较差。生物化学型蛋白质芯片则是指把生物活性分子（如抗体、受体、配体等）通过生化反应结合到芯片表面，用于捕获样品中的靶蛋白。由于生物化学型芯片具有高度的特异性及生物活性分子的多样性，其应用范围和前景明显优于化学型蛋白芯片。二、蛋白质芯片的制作和检测基本流程1. 制备抗体文库 利用噬菌体展

32、示等技术制备2. 选择固相载体片基 常用的载体片基材质有硅、云母、各种膜片等。特定处理后承载吸附有关的生物活性分子。3. 制备探针蛋白质及点样4. 制备待检样品、标记及与芯片进行抗原抗体反应 5. 蛋白质的检测 基质辅助的激光解吸附电离化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)表面加强激光解析电离化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)基质辅助的激光解吸附电离化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)原理：利用激光脉冲辐射使芯池中的待分析样品解离形成荷电离子，由于具有不同质荷比，这些离子在仪器场中飞行的时间长短不一，由此绘制出一张质谱图，经计算机软件处理得到模拟谱图，对结果进行分析。特点：快

33、速、敏感，特异性高，同时不会破坏所测定的蛋白质。二、蛋白质芯片制作和检测的基本流程FBMSCFBVEGFIL6MIP-1b IGF-1HGFosteoprotegrinPosNeg蛋白质芯片Antibody-based protein array由于蛋白数目极其庞大 (200000), 利用蛋白质芯片建立蛋白高通量检测技术去研究在不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体，从而揭示和说明生命活动的基本规律, 其将会使生命科学的研究进行另一次飞跃。蛋白质芯片的优缺点优点:高效率: 同时检测成千个蛋白敏感性高缺点:制作复杂,成本较高 现行没有令人满意蛋白质表达系统优点三、蛋白质芯片的应用在基础研究中的作用抗原-抗体相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用、酶-底物相互作用、配体-受体相互作用、高通量的蛋白质表达筛选及检测翻译后修饰等 2. 在临床研究中的作用发现新的疾病标志物作为临床诊断的指标（正常人群和疾病人群蛋白表达谱的比较）对疾病病理分子机