细菌内毒素检查10.内毒素工作标准品效价标定

1、内毒素工作标准品效价标定湛江安度斯生物有限公司2017年5月内毒素工作标准品效价标定背景方法举例（一）背景近期，经常接到用户有关如何进行细菌内毒素工作标准品效价标定的咨询。BET法中并没有要求对CSE效价进行复核，因此，我整理相关的法规、指南的要求供大家参考：YYT 0618-2007 细菌内毒素试验方法 常规监控与跳批检验3药品生产质量管理规范（2010年修订）第二百二十七条 标准品或对照品的管理452010版实验室控制系统GMP实施指南内毒素工作标准品效价标定方法标定方法凝胶法光度测定法（动态浊度法/动态显色法/终点显色法）标定参考资料中国药典2015年版通则1143细菌内毒素检查法论文：

2、第 7 批细菌内毒素国家标准品的建立 作者：蔡 彤 , 张国来 , 高 华 (中国药品生物制品检定所 , 北京100050) 61.实验材料试剂内毒素国家标准品（细菌内毒素检测用）凝胶法鲎试剂（最好两批不同灵敏度试剂）细菌内毒素检查用水内毒素工作标准品实验器具同凝胶法试验。7（二）标定方法-凝胶法2.实验步骤（1）标准内毒素溶液的制备 根据鲎试剂标示灵敏度，将国家标准品稀释制备成2.0、0.5和0.25浓度的内毒素标准溶液；（2）待测工作标准品内毒素溶液的制备 按照标示效价（Pe），用Vml BET水溶解，然后稀释制备成2.0、0.5和0.25浓度的内毒素溶液；（3） 用同一批号鲎试剂同时测定

3、两系列内毒素，每一浓度平行4管，阴性对照平行2管；8（二）标定方法-凝胶法3.计算方法（1）只有当国家标准品的2.0平行管均为阳性， 0.25平行管均为阴性，且阴性对照为阴性时，实验方为有效。（2）计算工作标准品的稀释倍数 D1=Pe/V/2.0，D2=Pe/V/，D3=Pe/V/0.5，D4=Pe/V/0.25（3）工作标准品效价Pt的计算 Pt=antilog（X/n）antilog（D/4） V（EU/支）其中X为国家标准品系列反应终点浓度的对数值，D为工作标准品系列反应终点稀释倍数的对数值。9（二）标定方法-凝胶法10（二）标定方法-凝胶法4.举例（1）设工作标准品的效价为10EU/支

4、，使用标示灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂进行标定。加入1ml细菌内毒素检查用水溶解标准品。（2）工作标准品的稀释倍数为： D1=Pe/V/2.0=101 0.5=20， D2=Pe/V/=10 1 0.25=40， D3=Pe/V/0.5=101 0.125=80， D4=Pe/V/0.25 =101 0.0625=160（二）标定方法-凝胶法11（3）反应结果为：国家标准品浓度（EU/ml）平行管数0.50.250.1250.0625NC反应终点浓度1+0.252+0.253+0.254+0.25工作标准品稀释倍数平行管数204080160反应终点稀释倍数1+402+403+404+40

5、12（二）标定方法-凝胶法（二）标定方法-凝胶法13（4）计算Pt：antilog（X/4）=antilog（lg0.25+lg0.25+lg0.25+lg0.25）/4=0.25 EU/ml antilog（D/4）=antilog（lg40+lg40+lg40+lg40）/4=40倍 Pt=0.2540 1=10 EU/支1.实验材料试剂内毒素国家标准品（细菌内毒素检测用）光度法鲎试剂细菌内毒素检查用水内毒素工作标准品内毒素定量测定仪（动态试管仪/酶标仪）实验用具同光度法试验。14（二）标定方法-光度测定法2.实验步骤（1）标准内毒素溶液的制备 将国家标准品稀释制备成1.0、0.5、0.2

6、5、0.125和0.0625EU/ml浓度的系列标准内毒素溶液；（2）待测工作标准品内毒素溶液的制备 按照标示效价（Pe），用Vml BET水溶解，然后稀释制备成1.0、0.5、0.25、0.125和0.0625EU/ml浓度的系列内毒素溶液；（3） 用同一批号鲎试剂同时测定两系列内毒素，每一浓度平行2管，阴性对照平行2管；15（二）标定方法-光度测定法3.计算方法（1）反应结束后，利用内毒素定量测定仪所配的程序软件计算标准曲线和工作标准品的内毒素浓度；（2）实验有效性判断：阴性对照的反应时间大于标准曲线最低点的反应时间相关系数的绝对值大于等于0.980标准曲线上各点的变异系数CV小于10%1

7、6（二）标定方法-光度测定法试验有效（3）确定实验为有效后，计算工作标准品的效价。首先去除无效的点 落在标准曲线以外的点（即其反应时间大于标准曲线最低浓度点的时间，或反应时间小于标准曲线最高浓度点的时间）CV大于10%的点将剩余的各点浓度乘以各自的稀释倍数，即得到工作标准品的原浓度。再将各原浓度进行算术平均再乘以加入水的体积，即为工作标准品效价。17（二）标定方法-光度测定法18（二）标定方法-凝胶法4.举例（1）设工作标准品的效价为10EU/支，使用标示检测灵敏度范围为100.03EU/ml的动态浊度法鲎试剂进行标定。加入1ml细菌内毒素检查用水溶解标准品。（2）选择标准曲线浓度1、0.5、

8、0.25、0.125和0.0625EU/ml，计算对应工作标准品的稀释倍数为：10、20、40、80和160倍；（3）检测19（4）反应结果标准曲线范围10.0625EU/ml,反应平均时间998.52586.5秒。相关系数绝对值|r|=0.99490.980TNC（7200s）T试验有效试验有效CV10%，无效！标准曲线外，无效！（5）结果判断和计算Pt内毒素浓度（EU/ml）0.06250.1250.250.51.0反应时间（秒）2586.52236.51599.51293.5998.5标准曲线信息2021结果判断和计算Pt:稀释倍数16080402010反应时间（S）2584.520081591.51233987CV（%）16.721.410.760.234.44原液浓度（EU/ml）11.10411.32810.93211.24810结果判断无效有效有效有效无效计算Pt（EU/支）（11.328+10.932+11.248）31=11.1691.使用细菌