Thapsigargin对人晶状体上皮细胞系SRA0104增殖抑制的作用机制

1、Thapsigargin对人晶状体上皮细胞系SRA01/04增殖按捺的作用机制姬红培，吴明星，彭瑞萍【摘要】【目的】研究thapsigarginTG对体外造就的人晶状体上皮细胞系SRA01/04增殖的影响，并探究其分子机制。【要领】差异浓度TG处置惩罚SRA01/04细胞72h，噻唑蓝比色法TT检测细胞增殖；流式细胞仪PI法检测细胞周期改变；透射电镜不雅察细胞超微布局变革；TUNEL法检测细胞核中DNA的断裂环境；激光共焦显微镜和流式细胞仪检测aspase3活性亚单元17/19ku的表达及阳性细胞表达率。【效果】TT法测得TG为0.3255l/L时，细胞增殖按捺率变革明显，I50约莫为0.8l

2、/L;透射电镜表现TG处置惩罚SRA01/04细胞膜皱缩，染色体浓缩、边集、核膜裂解、凋亡小体形成;流式细胞仪PI法及TUNEL法检测TG浓度为0，0.1，0.5，1，10l/L别离处置惩罚SRA01/04细胞72h，细胞凋亡率随浓度的增长而增长，呈浓度依靠性;TG处置惩罚后细胞aspase3阳性表达率也呈浓度依靠性增长,TG为10l/L时，险些每个细胞浆内aspase3都被激活。【结论】Thapsigargin大概通过激活aspase3为诱导体外造就的人晶状体上皮细胞系SRA01/04细胞凋亡而按捺其增殖，TG为防范后发性白内障的药物研究提供了基矗【关键词】Thapsigarigin；晶状体

3、上皮细胞；细胞凋亡；aspase3EffetandehanisfThapsigarginnPrliferatinfHuanLens后发性白内障是白内障术后影响视成效的严峻的远期并发症之一，白内障术后残留的晶状体上皮细胞增殖、迁徙、化生是其产生的病理底子1。如今手术中技能和人工晶状体的光学部方案等方面的革新使后发性白内障的产生率有所落落2,3，但白内障术后残留的晶状体上皮细胞的增殖还是眼科界亟待办理的的困难。后发性白内障防治的关键是创造一种能有用按捺晶体上皮细胞增殖且无显着毒性作用的药物。Thapsigargin(TG)是上世纪70年代从草药Thapsiagargania根部所提取的一种蓓半萜内

4、酯，特异性按捺细胞内质网钙泵4，粉碎a2+的动态平衡，影响晶状体上皮细胞增殖等生物学成效5，6。我们将TG处置惩罚体外造就的人晶状体上皮SRA01/04细胞，研究TG可否按捺SRA01/04细胞的增殖，并探究其分子机制，为药物防治后发性白内障提供新途径。1质料和要领11质料人晶状体上皮细胞系SRA01/04细胞：由Ruddy实行室创立，美国Tuft大学的商福传授奉送。重要试剂：Thapsigargin(TG)、Hehst33342、TT、PI、RNaseA、多聚赖氨酸均为美国Siga公司产物；leavedaspase3抗体ellsignaling；TUNEL试剂盒(南京凯基生物科技生长)；DE

5、造就基、新生牛血清美国Gib公司产物。重要仪器：2造就箱美国SHELLAB公司，KX41型倒置显微镜日本LYPUS公司，超净事情台苏州安泰气氛技能，LS510型激光扫描共焦显微镜德国Zeiss公司，荧光显微镜德国Axiplan2iaging，FASAria流式细胞仪美国BD公司，H-600型透射显微镜日本日立公司。1.2要领1.3统计学阐发运用SPSS13.0软件举行统计学阐发，对差异浓度TG作用72h后各组检测效果接纳非参数查验要领Kruskal-allisTest和单因素方差阐发ANVA，组间比力接纳SNKStudent-Nean-Keuls法，取?琢=0.05。2效果2.1细胞生长曲线当

6、TG浓度为0.3252.5l/L时，细胞增殖按捺率变革明显，且呈剂量依靠性，I50约为0.8l/L(图1)。2.2细胞周期漫衍变革流式细胞仪检测表现，正常组仅有正常的G1峰，未见亚二倍体峰；而TG处置惩罚组72h的G1峰左侧出现亚二倍体峰型，且该峰在整个细胞周期中所占百分比例随着TG浓度的增长而增长，具有浓度依靠性。统计接纳ANVA法，F=9412.58，P0.05。各组间比力均有明显性差异P0.01，图2。2.3细胞超微布局的改变TG处置惩罚组中细胞的胞浆产生浓缩，胞核内染色质浓集、贴边聚拢在核膜四周、染色质形成新月体样变革和凋形成亡小体等典范的细胞凋亡改变的特性图3。2.4细胞原位凋亡标识

7、表记标帜原位末了标识表记标帜的SRA01/04细胞中，细胞核内存在棕黄色/棕褐色的颗粒状沉淀，外形不一，有的核全染，有的染成新月状，有的呈点状。在正常比较组，TUNEL阳性颗粒非常少见，而随着TG浓度的增长，TUNEL阳性细胞所占百比例随着增长，呈浓度依靠性图4。2.5apase3活性亚单元的阳性表达美国ellsignaling公司最新消费的兔抗人leavedaspase3抗体能特异性检测aspase3的17/19ku活性亚单元，而对完备的aspase3及别的aspases的活性片断无免疫反响。细胞核Hehst33342，蓝色荧光体积变小大概形成凋亡小体等具有凋亡特性的细胞的胞浆内出现点状大概

8、布满性leavedaspase3免疫反响阳性荧光FIT，绿色荧光，而细胞核形态完全正常者那么表示为leavedaspase3免疫反响阴性图5。该效果证明了aspase3只在细胞凋亡时被激活理论，同时也说明TG大概通过aspase家属诱导人SRA01/04细胞凋亡，区别于少数非aspase家属凋亡途径。另一方面流式细胞仪检测leavedaspase3细胞阳性表达率的效果表现：随着TG浓度的增长，leavedaspase3细胞阳性表达率显着增长，且呈剂量依靠性，当TG为10l/L，险些为100%图6。统计阐发接纳ANVA，F=127.779，P0.001。除0.1l/L及0.5l/L组无明显性差异

9、P=0.140，别的各组间比力均有明显性差异P0.01。3讨论3.1TG诱导人晶状体上皮细胞系SRA01/04凋亡TG按捺SRA01/04细胞的增殖，TT法检测I50约莫为0.8l/L。流式细胞仪检测效果表现处置惩罚组在细胞周期的G1峰前出现亚G1峰,且该峰在细胞周期中所占的百分比随着TG浓度的增长而增长；透射电镜进一步地证明了细胞的超微布局产生了改变：细胞膜皱缩；染色体浓缩、边集，凋亡小体形成，这些效果均表白TG诱导了SRA01/04细胞凋亡。TUNEL法检测细胞凋亡比例也随着TG浓度的增长而增长,呈浓度依靠性。因此，TG是通过诱导细胞凋亡而按捺SRA01/04细胞增殖的。3.2TG剂量依靠

10、性激活aspase3哺乳动物细胞的步伐性殒命是在必然条件下诱导的通过一系列信号级联转导的有秩序的殒命历程。除少数细胞经非aspase依靠途径凋亡,大多数细胞是经aspase依靠途径凋亡。aspase级接洽统在凋亡诱导历程中饰演了极其紧张的脚色，而在aspase级联信号传导历程中，aspase3又称PP32,TAA,appain如今被普及以为是aspase家属中效应aspase卵白，是细胞凋亡卵白酶级联反响的必经之路和关键的调治点7。在原核细胞中，凋亡效应卵白编码基因包罗SP-1和SP-2，果蝇属那么包罗DRIE，DP-1，DEAY，DATDREA，它们和哺乳动物的aspase3的基因编码存在极

11、其相似的同源守旧序列。aspase3在正常环境下以无活性的酶原情势分子量31594u存在于细胞质内，当细胞凋亡时被激活，形成大17ku小12ku两个活性片断从而发挥生物学成效7。共聚焦显微镜和流式细胞仪的效果与如今以为的凋亡与aspase3之间的相干性是同等的8，9。这些效果更进一步地说明TG诱导SRA01/04细胞凋亡，另一方面也说明白细胞是经aspases途径凋亡。如今普及担当的不雅点以为，凋亡具有三种途径：细胞膜殒命受体途径、线粒体途径、内质网应激途径，此中内质网应激途径受到越来越多的存眷。而20世纪90年代初，Thastrup和Sabala就别离提出，TG是一种内质网/肌浆网上a2+-

12、ATPase的按捺剂，从而对胞内a2+信号举行调治10，11。以是我们推测aspase3的激活大概是由于TG按捺SRA01/04细胞内质网a2+-ATPase，粉碎内质网内a2+动态平衡，造成内质网应激，激活上游的aspases，如aspase12等。aspase3的激活导致细胞出现典范细胞凋亡形态学改变。可以想象，假设在白内障术接纳TG处置惩罚的人工晶体大概对超声乳化团结人工晶体植入术后晶状体上皮细胞的增殖起到按捺作用，TG有大概成为防治后发性白内障的临床应用的药物。无论在生理状态、白内障试验模子以及白内障患者，中心与周边地区的晶状体上皮细胞生长特性都存在差异，因此相应的增殖本领差异12。在高糖环境下LE增殖本领差异程度的受到影响，大概与糖性白内障