抗旱性指标实验方法

1、抗性指标实验方法目录TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark2 o Current Document -氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）1 HYPERLINK l bookmark16 o Current Document 【注意事项】2 HYPERLINK l bookmark20 o Current Document 二愈创木酚过氧化物酶（POD）活性的测定愈创木酚法3 HYPERLINK l bookmark30 o Current Document 【注意事项】4 HYPERLINK l bookmark32 o Current Docume

2、nt 三CAT（过氧化氢酶）的测定5 HYPERLINK l bookmark46 o Current Document 【注意事项】6 HYPERLINK l bookmark50 o Current Document 四、丙二醛（MDA）含量的测定6 HYPERLINK l bookmark62 o Current Document 【注意事项】7可溶性总糖的测定7 HYPERLINK l bookmark66 o Current Document 六叶绿素含量的测定8 HYPERLINK l bookmark78 o Current Document 七、采用饱和称重法测定叶片相对含水量

3、（RWC）9 HYPERLINK l bookmark80 o Current Document 八、采用电导率法测定相对电导率（REC）10 氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）（测量避光，光影响极大）【仪器、材料与试剂】（一）仪器分光光度计台式离心机（二）材料磷酸氢二钠磷酸二氢钠甲硫氨酸EDTA-Na2核黄素氮蓝四唑（NBT）陶瓷小研钵4-5ml离心管10ml玻璃试管（三）试剂0.05mol/L磷酸缓冲液（PBS,pH7.8）：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：取NaHPO12H0（分子量358.14）71.7g；242B母液:0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaHP0

4、2H0（分子量156.01）31.2g。242分别用蒸馏水定容到1000ml。0.05mol/LPBS（pH7.8）的配制：分别取A母液（NaHP）228.75ml,B母液（NaHPO）21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。2414.5mM甲硫氨酸溶液：称取1.0818gMet用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至500ml。3mMEDTA-Na溶液：称取0.1117gEDTA-Na用磷酸缓冲液定容至100ml。2260口M核黄素溶液：称取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存。2.25mM氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.092gNBT用PBS定容至50m1,避光保存。【实

5、验步骤】酶液提取称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml（0.6ml、0.5ml、0.5ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4C、12000g下离心20min,上清夜即为SOD粗提液。酶活性测定（1）反应混合液配制（以60个样为准）：分别取配好的Met溶液162ml,EDTA-Na溶液6ml,NBT溶液6ml,核黄素溶液6ml,混合后充分摇匀；2（2）分别取3ml反应混合液和40口l（可视情况调整）酶液于指形管中此即反应管；同时做两支对照管，其中1支试管加3ml反应混合液和40ulPBS（不

6、加酶液）作为最大光还原管，另1支加3ml反应混合液和40ulPBS同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。（3）将试管置于光照培养箱中在4000lux光照25C下反应20min；（4）反应结束后以不照光的对照管调零，分别测定各管在560nm下的吸光度（OD）560计算结果已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活单位（U）,按下式计算活性n=（OD-OD）/OD/2max560maxSOD总活性=（Ack-AE）xV/（1/2AckxWxVt）SOD比活力=SOD总活性/蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/gFW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸

7、光度；Ae为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时的酶液用量（ml）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为mg/g。【注意事项】酶液提取须在4C下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降；植物中的酚类物质对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或pvpp等，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。NBT反应液配好后过滤除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要避光保存，充分摇匀然后使用。加反应液时最好在暗光下进行；核黄素产生O.,NBT还原为篮甲潛都与光照密切相关，照光强度和时间2要严格控制。光照培养箱内壁裱糊锡箔纸，使箱内均匀光照约达40umolm-2s-1

8、，同时使照光时间一样，选择试管尽量一致，照光结束后测一个拿一个（最好晚上做）（温度高时照光时间缩短，温度低时延长）；测定活性时加入的酶量，以能抑制反应的50为佳。（一个酶单位相当于引起反应液达到半抑制时酶的用量，即以能抑制反应50的酶量为一个SOD酶活性单位。）（反应液中加酶液与PBS调零差异不大，反应液调零与其它两个则有一定差异。李合生方法：2支CK管均以缓冲液代替酶液。）【参考文献】BeauchampC,FridovichI.Superoxidedismutase.Improvedassaysandanassayapplicabletoacrylamidegel.AnalBiochem,1

9、971,44:276-287.ZhouW,ZhaoD,LinX.Effectsofwaterloggingonnitrogenaccumulationandalleviationofwaterloggingdamagebyapplicationofnitrogenfertilizerandmixtalolinwinterrape（BrassicanapesL.）.J.PlantGrowthRegul,1997,16,47-53.二愈创木酚过氧化物酶（POD）活性的测定-一愈创木酚法【实验原理】在过氧化物酶催化下，H0将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm22处有最大光吸收，故可通过测4

10、70nm下吸光值变化测定过氧化物酶活性。【仪器、材料与试剂】（一）仪器分光光度计台式离心机（二）材料磷酸氢二钠磷酸二氢钠2-甲氧基酚30HO22陶瓷小研钵2ml离心管（三）试剂0.2mol/L磷酸缓冲液（pH6.0）：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：取NaHP-12H0（分子量358.14）71.7g；B母液:0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaHPO2H0(分子量156.01)31.2g。242分别用蒸馏水定容到1000ml。0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)的配制：分别取A母液(NaHPO)12.3ml和B母液24(NaHPO)87.7ml混匀即为100mlPBS(0.2M

11、,pH6.0)；24【实验步骤】酶液提取称取0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml(0.6ml、0.5ml、0.5ml)50mmol/L预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4C、12000g下离心20min,上清夜即为酶粗提液。酶活性测定(1)反应混合液的配制：取50mlPBS(pH6.0,0.2M)缓冲液于烧杯中，加入28口l愈创木酚(2-甲氧基酚)于磁力搅拌器上加热搅拌，直至溶解愈创木酚溶解，待溶液冷却后加入19口l30%的H0,混匀后保存于冰箱中备用。22(2)酶活性测定：取3ml反应液并加入40口l酶液后测

12、定OD值在40秒的变470化。以PBS代替酶液为对照调零，计算结果以每min0D值变化(升高)0.01为1个酶活性单位(u)。，按下式计算活性POD活性=(A470XVt)/(WXVsX0.01Xt)(u/gFW)AA470:为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积(ml)；Vs为测定时取用酶液体积(ml)。【注意事项】反应液配制时由于愈创木酚难溶，应加热一段时间。加入H0前注意溶22液冷却，防止H0的挥发。22由于该反应迅速，加入酶液要立即进行吸光值的测定。参考文献J.L.Munoz-Munoz,F.Garcia-Molina,P.A.Gar

13、cik-Ruiz,E.Arribas,J.Tudela,F.Garcik-Canovas,J.N.Rodriguez-L6pez,Enzymaticandchemicaloxidationoftrihydroxylatedphenols.FoodChemistry,Volume113,Issue2,15March2009,Pages435-444F.Quintanilla-Guerrero,M.A.Duarte-Vazquez,B.E.Garcia-Almendarez,R.Tinoco,R.Vazquez-Duhalt,C.Regalado,Polyethyleneglycolimprove

14、sphenolremovalbyimmobilizedturnipperoxidase,BioresourceTechnology,Volume99,Issue18,December2008,Pages8605-8611三CAT(过氧化氢酶)的测定【实验原理】过氧化氢酶(Catalase,CAT),是一种广泛存在于生物组织中的氧化还原酶，它能催化HO分解为水和氧气，清除组织中的过氧化氢。HO在240nm处有一个2222吸收高峰，其吸光度与HO的含量成正比，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶22液吸光度(A240)随反应时间而降低。单位时间内吸收的差值就是过氧化氢酶的活性。【仪器、材料与试剂】仪

15、器分光光度计台式离心机材料植物叶片等植物材料试剂0.15mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)：取A母液(NaHP)228.75ml和B母液(NaHPO)146.25ml混合后用蒸馏水定容至500ml。240.3%HO:吸取0.5ml30%的H0,用PBS(pH7.0)定容至50ml。2222【实验步骤】酶液提取称取0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml(0.6ml、0.5ml、0.5ml)50mmol/L预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4C、12000g下离心20min,上清夜即为CAT粗提液。2酶活性测定反应混

16、合液的配制：取100mlPBS(0.15M,pH7.0),加入0.1546ml30%的H0摇匀即可。22取2.9ml反应液加入0.1ml酶液，以PBS为对照调零，测定OD240值在40s内的变化。3结果计算：酶活性计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位(u)。CAT=A240XVt/(WXVsX0.01Xt)(u/gFW)AA240：为反应时间内吸光度的变化;W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积(ml)；Vs为测定时取用酶液体积(ml)。注意事项】HO易分解，应现用现配。22【参考文献】AebiH（1984）Catalaseinvitro.In:Pack

17、erL（ed）Methodsinenzymology.Orlando,FL:AcademicPress,pp121-26四、丙二醛（MDA）含量的测定【实验原理】MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸（TBA）反应，形成在532nm波长处有最大光吸收的有色三甲基复合物。【仪器、材料与试剂】（一）仪器分光光度计台式离心机（二）材料磷酸氢二钠磷酸二氢钠三氯乙酸硫代巴比妥酸陶瓷小研钵6.10ml离心管（三）试剂5%的三氯乙酸（TCA）溶液：称取5g三氯乙酸用少量蒸馏水溶解后定容于100ml容量瓶中；0.67%（w/v）硫代巴比妥酸（TBA）溶液：称取0.67g硫代巴比妥酸用10%三氯乙酸溶液溶解后定

18、容于100ml容量瓶中。【实验步骤】取0.5g样品（叶片或根系）剪碎放入研钵中，加入5ml5%TCA溶液研磨成匀浆后转入离心管中在3000r/min下离心20min；取上清液2ml于离心管中，加入等体积的0.67%TBA（硫代巴比妥酸）混和后在100C沸水浴中煮30min，用冷水迅速冷却后在3000r/min下离心10min；3.取上清液在450nm、532nm、600nm下测OD值(用去离子水调零)；计算组织中MDA含量：MDA浓度C(umol/L)=6.45(OD-OD)-0.56OD532600450MDA含量(umol/gFW)=CXV/W式中V为提取液体积(1.8ml),W为样品鲜重

19、(0.5g)。【注意事项】加热时间不宜过长煮沸后要再进行一次离心【参考文献】KumarGNM,KnowlesNR.Changesinlipidperoxidationandlipolyticandfree-radicalscavengingenzymeactivitiesduringagingandsproutingofpotato(Solanumtuberosum)seed-tubers.PlantPhysiol,1993,102:115124五.可溶性总糖的测定【实验原理】实验采用蒽酮比色法测定可溶性总糖的含量。糖在硫酸作用下生成糖醛,糖醛与蒽酮作用形成绿色络合物,在一定范围内,颜色深浅与

20、糖含量有关。在625nm波长下的OD值与糖含量成正比。方法简单，但没有专一性。【仪器、材料与试剂】(一)仪器分光光度计恒温水浴锅分析天平烘箱刻度试管(二)材料活性炭刻度试管、漏斗酒精(20%)植物叶片或种子滤纸(三)试剂葡萄糖标准液：80C烘箱烘至恒重的葡萄糖lOOmg，配成500ml溶液，即为200口g/ml的标准液，蔥酮试剂：100mg蔥酮溶于100ml稀硫酸（76ml浓硫酸加30ml水中）。酒精（20%）：20ml酒精溶解至100ml。【实验步骤】可溶性糖的提取各种植物叶片或种子在110C烘箱中烘15min,然后调至70C过夜。干叶片磨碎后称取50mg样品倒入10ml刻度试管内，加入4m

21、l80%酒精，置于80C水浴中不断搅拌40min,离心，收集上清液，残渣加2mll80%酒精重复提取2次，合并上清液。在上清液中加10mg活性炭，80C脱色30min，定容至10ml，过滤后取滤液测定。显色及比色吸取上述酒精提取液1ml，加5ml蔥酮试剂混合，沸水浴煮10min，取出冷却。在625nm处测OD值。从标准曲线上得到提取液中糖的含量。绘制标准曲线取标准糖溶液将其稀释成一系列0-100口g/ml的不同浓度的溶液。按上述方法分别测定OD值，然后绘制标准曲线。【参考文献】FairbairnNJ.AmodifiedanthronereagentJ.Chem.andInd.,1953（4）:

22、86中国科学院上海植物生理研究所，上海市植物生理学会.现代植物生理学实验指南M.北京：科学出版社，1999.127六叶绿素含量的测定【实验原理】根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。叶绿素a、b在95%乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm，类胡萝卜素为470nm，可据此列出以下关系式：Ca=13.95A6656.88A649Cb=24.96A6497.32A665Cx.c=（1000A4702.05Ca114.8Cb）/245Ca+b=6.1A66520.04A649式中：Ca、Cb分别为叶绿素a和

23、b的浓度；Cx.c为类胡萝卜素的总浓度。试剂及配制：95%乙醇【仪器、材料与试剂】（一）仪器1.分光光度计电子天平（三）试剂95乙醇【实验步骤】1.取新鲜植物叶片（或其他绿色组织），擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。称取待测剪碎的新鲜样品O.lg（可调整），共3份，分别置于试管中。每个试管加入5ml95乙醇，使样品完全浸泡在乙醇溶液中。置于暗处浸泡24h后，进行比色测定。将叶绿素色素提取液倒入比色杯内，以95为对照调零，在波长665nm、649nm和470nm下测定吸光度。按上面的公式分别计算叶绿素a、b和类胡萝卜素的浓度（mg/L）,a+b即得叶绿素总浓度。求得色素的浓度后，再按下式计算组织中单位鲜重的各色素的含量：叶绿体色素的含量=（色素浓度X提取液体积）/样品鲜重单位mg/g【参考文献】ArnonDL.Copperenzymesinisolatedchloroplasts,polyphe