捕获测序-V1121课件

1、GenCapTM 全基因捕获技术A technology invented from Johns Hopkins University01 捕获技术简介02 技术比较03 应用实例04 附录Bert Vogelstein， 美国科学院院士； 霍普金斯大学Sidney Kimmel癌症研究中心教授 世界界最著名的肿瘤基因专家，TP53抑癌基因发现者， 肿瘤中唯一一个演发模型VogelGram的发明人， 为肿瘤的基因学研究做出了重要的贡献。伍建博士 2000-2004年在北京大学获学士学位； 2004-2008年在美国哥伦比亚大学获得博士学位； 2008-2011年在美国约翰霍普金斯大学完成博士后

2、训练， 并在美国霍普金斯大学Sidney Kimmel癌症研究中心做兼职助理教授。全基因捕获技术发明人捕获测序能够降低2/3的肿瘤研究测序费用检测100个肿瘤样品？方法外显子组725个肿瘤相关基因捕获测序费用100*1.8W=180W100*0.6W=60W捕获测序能够降低1/2的测序费用直接用全外显子测序100*1.8W=180W1、先用捕获测序100*0.5W=50W2、假设有80个样品发现都是已知突变，再对剩下的20个样做全外显子组测序。20*1.8W=36W50+36=86W检测100个多基因遗传病样本？我们设计好的基因捕获探针与客户的DNA文库混合，目标区域基因片段被杂交到探针上，进

3、而通过生物素和streptavidin的磁珠结合被吸附到磁珠上；通过洗脱处理就能将非目标区域的DNA片段洗掉，得到我们所需要的目的基因, 利用新一代高通量测序技术对目标去域基因组进行测序、分析，从而找出研究或临床上所需要的生物信息。基因捕获技术原理和传统测序（Sanger）比较传统测序新一代测序样本处理技术PCR扩增基因捕获突变检测限15%0.5%成功率90%98%通量/仪器2M/周300G/周100个基因测序价格10-20万5000-10000元图形展示几种捕获技术的比较罗氏NimbleGenAgilentIlluminaMyGenostics探针类型生物素化寡DNA核酸探针生物素化RNA探

4、针DNA探针单链DNA探针基因捕获覆盖度一般好一般好基因捕获效率差一般一般好成熟Panel少少少25个个性化定制周期3个月2个月3个月30天捕获试剂盒定制价格（50个以上）(2000-3000)*n(1000-2000)*n(1000-2000*n3-5W（无论多少样本）成熟Panel基因数新生儿代谢疾病筛查Panel(筛查版)：苯丙酮尿，丙酸血症，同行半胱氨酸血症等153新生儿代谢疾病筛查Panel（全面版）：糖原累积病，尿素循环障碍等392自闭症筛查Panel：2013/7月以前所有报道过与自闭症相关的基因905耳聋基因Panel：2012年以前报道过与耳聋相关的基因102+线粒体700种

5、新生儿遗传疾病基因Panel：(包括发病率较高的各个方面，但每科不是最全的)505遗传性肿瘤相关基因Panel：家族性乳腺癌，大肠癌，前列腺癌，胃癌等91肿瘤个体化用药Panel：(42个药物代谢+118个高频突变肿瘤基因）160肿瘤高频突变基因Panel：Cosmic中肿瘤突变频率最高的基因725神经系统基因Panel：（ALS，CMT,LGMD,HSP）411眼科疾病基因Panel：（视网膜色素变性，青光眼，小眼球，黑朦，staugart等）371心血管疾病基因Panel：（肥厚心肌，扩张心肌，马凡等等）328癫痫疾病基因Panel：所有有癫痫症状的疾病相关基因308血液系统疾病基因Pan

6、el：（范可尼贫血，地中海贫血，血小板增多症等）290脑白质病基因Panel：脑白质症状相关基因154线粒体病基因Panel：线粒体病相关的所有核基因，包括leigh综合症1033线粒体基因全长16569bp:检测每个位点0.5%以上的杂合度DMD全基因（2.2Mbp）：包括内含子，外显子；检测突变，插入缺失，重复，能给出大片度重复缺失的断裂点序列脑血管病Panel:CADASIL等脑血管病相关的基因12软骨发育不全Panel:10成骨不全Panel:5白化病Panel: 白化病相关的基因9Kinome Panel: 所有Kinase基因537HBV、HIV、HPV、EBV病毒整合位点检测应用

7、实例1 ：DMD全基因捕获测序1.人类最大的基因，60%扩增，缺失，40%突变，发病率1/3500.病人DNAMLPA或者芯片CGH技术 检测出扩增或缺失（60-65%） 桑格测序技术检测出碱基突变（35-40%）病人DNA 新一代捕获测序技术一次性同时检测出扩增，缺失，碱基突变（100%）传统技术和捕获测序技术流程对比A2.Wang, Z., Cui, F., Chen, D., Pu, C., Chen, Z., Yang, F., Wu, H. and Huang, X. (2013), Coexistence of peripheral myelin protein 22 and dy

8、strophin mutations in a chinese boy. Muscle Nerve. doi:10.1002/mus.23918DMD基因检测结果无扩增或缺失扩增缺失 AAAGCTGTTTGTTAACGGTCCAGGTTTACTTCACTC TTCTAAAGCTGTTTGTTAACGGTCCAGGTTTACTTCAC CTTCTAAAGCTGTTTGTTAACGGTCCAGGTTTACTTCAC TCTTCTAAAGCTGTTTGTTAACGGTCCAGGTTTACTTCAC TTCTTCTAAAGCTGTTTGTTAACGGTCCAGGTTTACTTCA CTTCTTCTAA

9、AGCTGTTTGTTAACGGTCCAGGTTTACTTC ACTTCTTCTAAAGCTGTTTGTTAACGGTCCAGGTTTACTT TACTTCTTCTAAAGCTGTTTGTTAACGGTCCAGGTTTACT ATACTTCTTCTAAAGCTGTTTGTTAACGGTCCAGGTTTAC AATACTTCTTCTAAAGCTGTTTGTTAACGGTCCAGGTTTA突变A2.Wang, Z., Cui, F., Chen, D., Pu, C., Chen, Z., Yang, F., Wu, H. and Huang, X. (2013), Coexistence of

10、peripheral myelin protein 22 and dystrophin mutations in a chinese boy. Muscle Nerve. doi:10.1002/mus.23918DeletionaCGH发现D-WMXN样本在X染色体31.831.9Mb处，存在约110Kb的缺失片段测序结果吻合A2.Wang, Z., Cui, F., Chen, D., Pu, C., Chen, Z., Yang, F., Wu, H. and Huang, X. (2013), Coexistence of peripheral myelin protein 22 an

11、d dystrophin mutations in a chinese boy. Muscle Nerve. doi:10.1002/mus.23918DuplicationHuahong是Liuxiaorui的母亲，Huahong是携带者，Liuxiaorui是患儿。患儿Liuxiaorui是遗传了Huahong重复的片断。两个人的位置应该一致。测序发现的结果是两人重复的区域一致Sample: CD3Deletion:chrX:31792441-31848733Test Result for Sample CD3说明：Y轴为序列的数量，X轴为染色体位置，Y值加倍表示重复；Y值趋于0意味着缺失

12、；本样本在chrX:31792441-31848733区间发生大片段缺失，是导致DMD疾病的致病原因。下图是正常样本的覆盖图作为对照参考。应用实例2：线粒体相关疾病线粒体病是一大类遗传代谢病，发病频率约为1/200.线粒体病主要包括：母系遗传Leigh综合征，线粒体肌病，多系统疾病、心肌病、进行性眼外肌麻痹，Leer遗传性视神经病，线粒体肌病，肌病，糖尿病和 耳聋等等。线粒体大小16569bp，传统测序复杂且费用高昂。和传统PCR方法相比，捕获测序有如下优势：操作简单，不需要设计特定引物，没有PCR失败的风险对样本质量要求不高，石蜡包埋样本等无法用PCR方法的样本都适用测序的均匀性和覆盖度较P

13、CR方法好 每一个碱基突变检测灵敏度为2%线粒体相关心肌病辅助诊断实例样本线粒体位置参考碱基突变碱基突变碱基深度总测序深度突变频率MG_S119410AT25512040.2118MG_S119501GA24618590.1323MG_S119829AG24843100.0575MG_S1191721GA24320730.1172MG_S1192222AG24713200.1871MG_S1192354CT25521060.1211MG_S1192485CT25530900.0825MG_S1193243AG18421090.0872MG_S1194821GA24421120.1155MG_S

14、1195581CT25417290.1469MG_S1196024GA24948700.0511MG_S1196217TC24950390.0494应用实例4：TSC2外显子缺失诊断实例2，谢某，被医院诊断患有为结节性硬化症，主要表现颜面部皮脂腺瘤、癫痫、智力不足及眼部视网膜等处的病变。亦可有颅骨钙化，或合并心、肾、骨等部位的肿瘤。为常染色体显性遗传病。基因定位于9q34或16p13.3为肿瘤抑制基因，分别命名为TSC1和TSC2。 利用基因捕获测序技术，将TSC1, TSC2基因以及其他参考基因捕获出来进行新一代测序分析，100%检测此基因的所有外显子，在TSC2基因的40号外显子上发现了p

15、.P1737L的突变，但是这个突变的意义还不是很明确，所以不能立即判定此病人是由这个突变导致的。进一步的数据分析，发现了TSC2基因在40-44号外显子区域有缺失，导致TSC2蛋白缩短，功能缺失，可以判定为导致此病的主要原因。 40-44号外显子缺失应用实例5：多囊肾、成骨不全、马凡综合症多囊肾PKD1,PKD2： PKD1:c.del9082CT黏脂贮积症GNPTAB: p.Arg364X多巴反应性肌张力障碍GCH1: p.Arg57Gln成骨不全COL1A1/COL1A2： COL1A2：p.Gly280Ser马凡综合症FBN1: p.Gln1990X肥厚心肌病多基因： MYH7:R453

16、C 全外显子测序诊断结果实例：病人，王某，56岁，女，有家族性遗传病史，但不是很确定什么疾病数目总的新突变数812总的突变基因数486疾病相关基因突变数74无义突变数32错义突变数713剪切位点突变数67疾病相关基因中无义突变数7 （2种致病）疾病相关基因中错义突变数63 （7种可能致病）疾病相关基因中剪切位点突变数5全外显子测序诊断结果实例：病人，王某，56岁，女，有家族性遗传病史，但不是很确定什么疾病家族性冷因性自体发炎综合症NLRP12显性NLRP12:W408X家族性冷因性自体发炎综合症：家族性冷因性自体发炎综合症是冷因性荨麻疹的一种变相形式,是较少见的慢性荨麻疹。患者在接触冷水或食用

17、冷饮数分钟或数小时后,发生局部或全身性的荨麻疹。家族冷因性发炎综合症基因携带者主要在青年时段发病，五年内约有五成患者自行痊愈或改善，除上述接触冷水或食用冷饮诱发的主因外，部分患者还会因为其他特殊环境诱发，比如因感染幽门杆菌，昆虫叮咬，药物等而诱发。原发性开角型青光眼MYOC显性MYOC :R46X原发性开角型青光眼：发病隐蔽,进展较为缓慢,非常难察觉,故早期一般无任何症状,当病变发展到一定程度时,可出现轻度眼胀、视力疲劳和头痛,视力一般不受影响,而视野逐渐缩小。晚期视野缩小呈管状时,出现行动不便和夜盲。有些晚期病例可有视物模糊和虹视。一般在幼儿或少儿时出现临床表现。如在3岁以前发病,可出现羞明

18、、溢泪、眼睑痉挛和大角膜；3岁以后发病,则可表现为少儿进行性近视。根据美国Quigley的估算，2000 年全球的青光眼患者达6700万人，到2020年全球将有青光眼患者7960万，其中原发性开角型青光眼占2/33/4。 在亚洲，最近15年青光眼患病率的数据在不断增加，受研究条件和诊断技术水平的限制，研究质量参差不齐。1989年我国学者胡铮发表了顺义地区青光眼患病率数据，认为原发性青光眼的患病率在一般人群中是0.68%。应用实例7：线粒体相关眼病家系 方法：线粒体全基因捕获测序，检测每个2%以上的突变位点结果：母携带者：c.14484TC突变，突变率10.68%；子病人1：c.14484TC突

19、变，突变率100%；子病人2：c.14484TC突变，突变率100%；正常对照家庭成员：无突变应用实例9：眼科疾病基因筛查方法：从2ml血液中提取DNA, 捕获371种眼科相关疾病基因结果： （确诊LCA1这种眼科疾病）样本：发现GUCY2D:c.3176AC/-两个碱基纯合缺失，明确导致LCA1这种临床较难判断的眼科疾病。A1.Huang X-F, Xiang P, Chen J, Xing D-J, Huang N, et al. (2013) Targeted Exome Sequencing Identified Novel USH2A Mutations in Usher Syndr

20、ome Families. PLoS ONE 8(5): e63832. doi:10.1371/journal.pone.0063832应用实例10：新生儿遗传疾病确诊项目：一新生儿，临床患低血糖症，新生儿黄疸，肌张力不高等表现，临床很难进行明确诊断方法：从2ml血液中提取DNA, 捕获700种遗传疾病相关基因结果： DGUOK的基因编码区c.500处发现TATC纯合缺失，导致编码框移位，蛋白功能缺失。因此，明确诊断该疾病为mitochondrial DNA depletion syndrome type 3 (MTDPS3) MIM:251880应用实例11：X染色体全基因捕获测序项目：X

21、连锁的家系视网膜色素变性方法：从2ml血液中提取DNA, 捕获X染色体上的所有基因结果： 通过基因连锁分析，发现该家系成员的视网膜色素变性致病基因位点为：RPGR:S284X。通过此方法，找到了该家庭重要的发病原因，为临床确诊做出了重要参考。应用实例12：癫痫疾病辅助诊断项目：癫痫疾病的病人，亚型太多，无法准确判断方法：从2ml血液中提取DNA, 捕获315个癫痫相关基因深度测序结果： 基因染色体位置碱基改变氨基酸改变Het/hom测序深度可疑疾病CDKL5chrX186221541109delCFrameshiftHet785/881(0.47)Epileptic encephalopath

22、y, early infantile, 2X染色体显性遗传，高度怀疑应用实例13：耳聋患者基因检测实例项目：一耳聋患者，传统的耳聋热点筛查没有检测出相关基因方法：从2ml血液中提取DNA, 捕获已知耳聋相关的102个基因的所有外显子区域以及致病的线粒体相关区域结果： 通过基因分析，发现该耳聋患者的明确致病基因位点为：TMC1：D572N。通过此方法，找到了该家庭重要的发病原因，为临床诊断及将来的产前诊断做出了重要参考。应用实例14：ALS疾病相关基因检测实例项目：一ALS疾病患者，急需检测相关致病基因，以便其做产前诊断方法：从2ml血液中提取DNA, 捕获已知ALS相关的27个基因的所有外显子

23、区域，进行深度测序结果： 通过基因分析，在其SOD1基因发现一个突变，该突变造成SOD1基因在其编码区产生一个错义突变（p. L85F）。此突变被报道与ALS直接相关。因此，找到了该样本的明确致病性突变。应用实例15：CMT疾病相关基因检测实例项目：一临床上被诊断为CMT疾病的患者，需要明确致病基因位点以帮助明确诊断，同时还可辅助其做产前诊断方法：从2ml血液中提取DNA, 捕获已知CMT相关的33个基因的所有外显子区域，进行深度测序结果： 该样本在经由外显子捕获测序结果显示，在其GJB1基因编码区发现一个错义突变（pArg75Gln），这种错义突变造成基因编码蛋白氨基酸组成的改变。此突变曾被

24、报道与CMT直接相关，因此明确了该样本的致病原因。应用实例16：新生儿疾病辅助诊断实例项目：一临床上产生各种复杂症状，疑似leigh综合症，但又不能确证方法：从2ml血液中提取DNA, 捕获700新生儿遗传疾病相关的基因的所有外显子区域，进行深度测序结果： 该样本在经由新生儿700种遗传疾病基因全部外显子捕获测序结果显示，在其PDHA1的基因编码区发现N164S纯合突变，该突变曾被报道与Pyruvate dehydrogenase deficiency相关, 导致X连锁的Leigh Syndrome.因此，对该患者进行了确诊，同时还找到了致病原因。A3.Yang, Y., J. Wu, H.

25、Liu, X. Chen, Y. Wang, M. Zhao and X. He. Two Homozygous Nonsense Mutations of Gnptab Gene in Two Chinese Families with Mucolipidosis Ii Alpha/Beta Using Targeted Next-Generation Sequencing. Genomics, (2013).MyGenostics首席科学家发表文章14. Kinde I, Bettegowda C, Wang Y, Wu J, Agrawal N, Shih IeM, Kurman R,

26、Dao F, Levine DA, Giuntoli R, Roden R, Eshleman JR, Carvalho JP, Marie SK, Papadopoulos N, Kinzler KW, Vogelstein B, Diaz LA Jr. Evaluation of DNA from the papanicolaou test to detect ovarian and endometrial cancers. Sci Transl Med. 2013 Jan 9;5(167):16713. Mark Sausen, Rebecca J. Leary, Sin Jones,

27、Jian Wu, C. Patrick Reynolds, Xueyuan Liu, Amanda Blackford, Giovanni Parmigiani, Luis A. Diaz, Jr.1, Nickolas Papadopoulos, Bert Vogelstein, Kenneth W. Kinzler, Victor E. Velculescu, Michael D. Hogarty. Integrated genomic analyses identify ARID1A and ARID1B alterations in the childhood cancer neuro

28、blastoma. Nat Genet. 2012 Dec 16;45(1):12-17.12. Hanno Matthaei1,4, Jian Wu5,6, Marco Dal Molin1, Marija Debeljak1, Philipp Lingohr4, Nora Katabi7, David S. Klimstra7, N. Volkan Adsay8, James R. Eshleman1,2, Richard D. Schulick1,3, Kenneth W. Kinzler5, Bert Vogelstein5,9, Ralph H. Hruban1,2, Anirban

29、 Maitra1,2,*GNAS codon 201 mutations are uncommon in intraductal papillary neoplasms of the bile duct. HPB. 18 JUN 2012. (Co-first author).11. Luis A. Diaz Jr, Richard Williams, JianWu, Isaac Kinde, J. Randolph Hecht, Jordan Berlin, Benjamin Allen, Ivana Bozic, Johannes G. Reiter, Martin A. Nowak, K

30、enneth W. Kinzler, Kelly S. Oliner, Bert Vogelstein. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature, June 28th, 2012.10. Mitsuro Kanda*, Hanno Matthei*, Jian Wu*, Seung-Mo Hong, Jun Yu, Michael Borges, Ralph H. Hruban, Anirban Maitra, Bert Voge

31、lstein, Michael Goggins. A genetic basis for the initiation of pancreatic intraepithelial neoplasias. Gastroenterology 2012, Jan 5th. (Co-first author).9. Jian Wu, Yuchen Jiao, Marco Dal Molin, Anirban Maitra, Roeland DeWilde, Laura Wood, James Eshleman, Michael Goggins, Marcia L. Canto, Richard D.

32、Schulick, Barish H. Edil, Christopher L. Wolfgang, Michael Choti, Volkan Adsay, David Klimstra, G. Johan A. Offerhaus, Alison P. Klein, Levy Kopelovich, Rachel Karchin, Peter J. Allen, C. Max Schmidt, Luis A. Diaz, Jr., Kenneth W Kinzler, Nickolas Papadopoulos, Ralph H. Hruban, Bert Vogelstein. Whol

33、e-exome sequencing of neoplastic cysts of the pancreas reveals recurrent mutations in components of ubiquitin-dependent pathways.PNAS. 2011: 108 (52) 21188-21193.8. Wu J, Matthaei H, Maitra A, Dal Molin M, Wood LD, Eshleman JR, Goggins M, Canto MI, Schulick RD, Edil BH, Wolfgang CL, Klein AP, Diaz L

34、A Jr, Allen PJ, Schmidt CM, Kinzler KW, Papadopoulos N, Hruban RH, Vogelstein B. Recurrent GNAS Mutations Define an Unexpected Pathway for Pancreatic Cyst Development. Science Translational Medicine. 2011 Jul 20; 3(92):92ra66.7. Kinde I, Wu J, Papadopoulos N, Kinzler KW, Vogelstein B. Detection and

35、quantification of rare mutations with massively parallel sequencing. PNAS. 2011 Jun 7;108 (23):9530-5.6. He J*, Wu J*, Jiao Y, Wagner-Johnston N, Ambinder RF, Diaz LA Jr, Kinzler KW, Vogelstein B, Vogelstein B. “IgH gene rearrangements as plasma biomarkers in Non-Hodgkins Lymphoma patients”. Oncotar

36、get, Vol 2, No 3, 178-185, 2011. (Co-first author)5. Wang Q, Chaerkady R, Wu J, Hwang HJ, Papadopoulos N, Kopelovich L, Maitra A, Matthaei H, Eshleman JR, Hruban RH, Kinzler KW, Pandey A, Vogelstein B. “Mutant proteins as cancer-specific biomarkers”. PNAS, 108, (6) 2444-2449, 2011.4. He Y, Wu J, Dre

37、ssman DC, Iacobuzio-Donahue C, Markowitz SD, Velculescu VE, Diaz LA Jr, Kinzler KW, Vogelstein B, Papadopoulos N. “Heteroplasmic mitochondrial DNA mutations in normal and tumor cells”. Nature, 464, 610614, 2010.3. Guo J, Xu N, Li Z, Zhang S, Wu J, Kim DH, Sano Marma M, Meng Q, Cao H, Li X, Shi S, Yu

38、 L, Kalachikov S, Russo JJ, Turro NJ, Ju J. “Four-color DNA Sequencing with 3-O-modified Nucleotide Reversible Terminators and Cleavable Fluorophore-modified Dideoxynucleotides”. PNAS. (2008) 105: 9145-9150.2. Wu, Jian; Zhang, Shenglong; Meng, Qinglin; Cao, Huanyan; Li, Zengmin; Li, Xiaoxu; Shi, Shu

39、ndi; Kim, Dae Hyun; Bi, Lanrong; Turro, Nicholas J; Ju, Jingyue. “3-O-modified Nucleotides as Reversible Terminators for Pyrosequencing”. PNAS.2007, 104, 16462-16467.1. Ju J, Kim DH, Bi L, Meng Q, Bai X, Li Z, Li X, Marma MS, Shi S, Wu J, Edwards JR, Romu A, Turro NJ. “Four-color DNA Sequencing by S

40、ynthesis Using Cleavable Fluorescent Nucleotide Reversible Terminators”. PNAS. 2006, 103, 19635-19640.合作单位合作伙伴文章A4.Wang, L., S. Z. Dai, H. J. Chu, H. F. Cui and X. Y. Xu. Integration Sites and Genotype Distributions of Human Papillomavirus in Cervical Intraepithelial Neoplasia. Asian Pac J Cancer Prev 14, no. 6 (2013): 3837-41.A3.Yang, Y., J. Wu, H. Liu, X. Chen, Y. Wang, M. Zhao and X. He. Two Homozygous Nonsense Mutations of Gnptab Gene in Two Chinese Families w