分析方法验证课件

1、液相色谱法方法验证岛津国际贸易（上海）有限公司分析仪器事业部 分析中心为什么要进行方法验证？方法验证的目的 判断该方法是否科学、合理，是否能有效控制药品的内在质量。方法验证的流程 方法开发法规规定需要进行考察的内容制定验证实验计划(Validation Plan)进行验证实验汇总和处理实验数据确认实验数据，填写验证报告。由质量负责人审批通过后以质量管理文件形式保存定期回顾，如有变更，确认是否需要进行再验证和如何进行再验证为什么要进行方法验证？方法验证的意义 药品的生产过程中，原料、中间体、成品均需进行检验，检验结果既是过程受控的依据，也是评价产品质量的重要依据，检验结果应准确可靠。而分析方法的

2、验证为检验结果的准确性及可靠性提供了可靠保证。 方法验证可以分成两种类型： 1）药典或注册分析方法的验证 2）非药典或注册分析方法的验证 （一般为企业针对自身的产品而自行开发的方法）相关法规ICH （用药品注册技术要求国际协调会）相关法规 ICH Q2（R1）、Q2A、Q2B药典 各国药典对分析方法验证均有具体的规定。 2010版中国药典附录 XIX A 药物质量标准分析方法验证指导原则 USP Validation of compendia methodsFDA相关法规 色谱方法验证审评指南验证方法开发和方法验证的关系方法开发是实现方法验证的先行步骤 方法验证是检验方法开发是否成功的依据 方

3、法开发阶段仍需要进行部分的方法验证的内容 - 如：考察保留时间的重现性方法开发与方法验证的关系图 方法开发方法验证方法适用方法不适用验证不通过验证通过重新进行方法开发，并检讨方法开发流程确定为SOP方法验证的前提条件仪器：仪器设备经过验证和校正，且在有效期内人员：经过充分的培训，熟悉方法以及所使用的仪器物料：使用符合相关规定的物料（包括标准品、试剂、容器等）方法：该分析方法的开发和优化已经成功完成，并且已经考察其耐用性。环境：试验环境符合该分析方法的要求。（洁净度、温度、湿度等）方法验证计划如何制定？不同的分析方法对验证项目的要求：验证项目鉴别杂质定性杂质定量测定含量溶出度等准确度-+精密度重

4、复性-+精密度中间精密度-+专属性+检测限-+-定量限-+-线性-+范围-+耐用性+准确度（Accuracy）准确度，是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度；表示分析方法的正确性。由于“真实值”无法准确知道，因此，通常采用回收率（%）来表示。涉及到定量测定的检测项目均需验证准确度，如杂质定量检查，含量和溶出方法，分析方法的准确度能够确保： 1） 样品中的待测物全部溶解 2） 待测物全部从检测器中检出 回收率（Recovery）测定回收率R的具体方法可采用： “回收试验法”和“加样回收试验法”回收试验 空白+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M 加样回收试验 已准确测定含量P的

5、真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M回收率（Recovery）对于检测的禁用物质，回收率应在方法测定低限、两倍方法测定低限和十倍方法测定低限进行三水平试验（n=3）；对于已制定最高残留量（MRL）的样品，回收率应在方法测定低限、MRL、选一合适点进行三水平试验；在加样回率收试验中须注意标准品的加入量与样品被测组分含有量之和必须在标准曲线线性范围内；应报告供试品取样量、供试品中含有量、对照品加入量、测定结果和回收率 ( ) 计算值，以及回收率 ( ) 的相对标准偏差 (RSD)回收率（Recovery）准确度的接受标准1）含量和溶出： a）各浓度下的平均回收率应在98.0%-1

6、02.0%之间 b）9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于2.0% c）中药检品一般应满足：回收率计算值在95%-105%范围2）杂质杂质含量水平接受标准0.2%绝对值0.05%0.2% - 1.0%相对值20%1.0%相对值10%指在规定测试条件下，同一均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间接近的程度。用偏差（d）、标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD) （变异系数，CV）表示。精密度（Precision）重复性（Repeatability） 是指在同一条件下对同一批样品，从样品液制备开始，制备至少六份以上供试品溶液(即 n 6), 或设计 3 个不同浓度，每个浓度各分别制备 3 份

7、供试溶液，进行测定，计算其含量的平均值和相对标准偏差RSD。接受标准：原料药方法验证时，活性成分的 RSD 1.0%；制剂方法验证时，活性成分峰 RSD 2.0%；杂质方法验证是，每个杂质峰 RSD 20%；中间精密度（ Intermediate Precision ） 同一批样品每位分析人员准备六份进行测量，计算两人之间平均值的差异。 接受标准：原料药方法验证时，平行六份样品的 RSD 1.0%，两人之间的 平均值之差 1.0% ；制剂方法验证时，平行六份样品的 RSD 2.0%，两人之间的 平均值之差 3.0% ；杂质方法验证是，平行六份样品的 RSD 20%，两人之间的平均值之差如下表：

8、杂质含量水平接受标准 0.2%绝对值0.05%0.2% - 1.0%相对值20%1.0%相对值10%准确度和精密度关系A 准确度好，精密度好B 准确度差，精密度好C 准确度好，精密度差D 准确度差，精密度差 指在其他成分（如杂质、降解物、辅料等）可能存在下，采用的分析方法能够正确鉴定、检出被分析物质的特性通常，鉴别、杂质检查、含量测定方法中均应考察其专属性。如果采用的方法专属性欠佳，应采用多个方法予以补充。专属性（ Specificity ）检测限（limit of detection，LOD） 检测限，是指试样中被测物能被检测出的最低量。检测限是一种限度检验效能指标，即反映方法与仪器的灵敏度

9、和噪音的大小，也表明样品经处理后空白 ( 本底 ) 值的高低。 可用已知低浓度样品测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以 S / N 3 时的相应浓度或注入仪器的量确定检测限。检测限的报告数据应附图谱， 说明测试过程和检测限结果。 定量限（1imit of quantitation，LOQ）定量限，是指在保证一定准确度和精密度的前提下，样品中被测物能被定量测定的最低量。常用信噪比法测定定量限。一般以 S / N 10 时相应的浓度或注入仪器的量进行确定。也可用仪器所测空白背景响应标准差（SD）的10倍为估计值，再经试验确定。应附典型图谱线性（lin

10、earity）线性，在设计的范围内，测试结果与试样中被测物质浓度呈线性关系的程度。 线性是定量测定的基础，涉及定量测定的项目，均需要验证其线性。应在规定的范围内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释，制备一系列供试品的方法进行测定，至少制备5个浓度（通常选择50%、80%、100%、120%、150%）。以测得的响应信号对被测物浓度作图，用最小二乘法进行线性回归。回归方程的相关系数 r 越接近于1，表明线性关系越好。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算，并说明依据。线性的接受标准 含量类型相关系数截距含量方法R 0.9997，或 R2 0.9992.0%定量杂质方法R 0.995，或

11、 R2 0.99020%范围范围指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。杂质定量检查、含量和溶出方法均应验证其范围，分析方法 的范围应根据具体分析方法以及对线性、准确度、精密度的结果和要求确定。范围通常用于分析方法测试结果相同的单位（如百分浓度）表达。涉及到定量测定的检测项目均需要对范围进行验证，如含量测定、含量均匀度、溶出度、杂质定量试验等。范围的接受标准对于半成品或者成品含量测试，范围通常为测试浓度的80% -120%。对于杂质测试，范围为测试浓度的50% -120%。对于含量均匀度测试，除了基于剂型本身特点而确定的更宽的范围外，范围应为测试浓度的70% -1

12、30%。对于溶出度测试，范围应为标准规定范围的20%。耐用性耐用性指测定条件发生小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，主要考察方法本身对可变试验因素的抗干扰能力。开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则建议在方法中予以说明。典型的变动因素在液相色谱法中，典型的变动因素包括：流动相的组成流速流动相的pH值不同厂家或者不同批号的同类色谱柱色谱柱操作温度被测溶液的稳定性，样品的提取次数、时间等耐用性在评估参数是需要获得改变条件后与标准条件下的测量结果，通过对改变条件后与标准条件下结果的比较来评估方法的耐用性。改变条件后与标准条件下结果的差异计算公式如下： %Differenc

13、e = 100 -100 Rm / Rs 其中， Rm - 改变条件后的含量结果， Rs - 标准条件获得的含量结果。典型例子耐用性参数实验描述通用认可标准强制变化参数1） 流动相pH0.2单位；2） 缓冲溶液浓度：规定浓度的90%-110%；3） 有机相比例相对变化1% (请使用预混合的流动相)比较标准方法的结果和改变方法后得到的结果，如果没有影响，则认为方法有耐用性；否者对应的参数必须在系统适应性测试中进行考察可选择变化参数以下方法参数在给定范围内变化：1） 相对规定提取时间的15%范围2） 超声时间（5，10，20分钟）3） 相对规定柱温的5范围4） 不同供应商的色谱柱5） 不同生产批次

14、的色谱柱6） 不同的QC实验室典型例子耐用性参数实验描述认可标准所测组分含量 97.0 %时，% Difference 1.0 %样品溶液稳定性1） 样品溶液在放置4/8/12/24小时或者更长的时间后进行检测2）样品溶液在室温保存下和低温保存的条件下存放一定时间后进行检测所测组分含量 97.0 %时，% Difference 2.0 %所测组分含量 10 %时，% Difference 5.0 %耐用性的接受标准对于原料药和制剂： 主要成分的含量差异不得大于1.5%对于杂质测试，接受标准如下：杂质水平接受标准 0.2%绝对值 0.05%0.2% - 1.0%相对值 20%1.0 %相对值 1

15、0%方法再验证方法再验证的定义：原料、工艺、处方、分析方法发生部分改变时，对分析方法再次进行全面或者部分验证，以保证分析方法可靠，这一过程称为方法再验证。方法再验证原则：根据改变的程度进行相应的再验证。实际应用例子变更内容可能存在的质量风险需验证的项目原料药合成工艺变更产生新的杂质，影响测定结果杂质检查方法和含量测定方法制剂处方改变，辅料变更影响鉴别的专属性、溶出度和含量测定的准确度鉴别、含量测定方法原料来源变更影响杂质检查和含量测定的专属性和准确度杂质检查方法和含量测定方法某一分析方法改变（如检测波长改变）方法修订不合理，影响该项目测定结果该方法全面验证实际应用例子变更内容可能存在的质量风险需验证的项目原料药合成工艺变更产生新的杂质，影响测定结果杂质检查方法和含量测定方法制剂处方改变，辅料变更影响鉴别的专属性、溶出度和含量测定的准确度鉴别、含量测定方法原料来源变更影响杂质检查和含量测定的专属性和准确度杂质检查方法和含量测定方法某一分析方法改变（如检测波长改变）方法修订不合理，影响该项目测定结果该方法全面验证方法再验证 方法再验证是对分析方法的完善过程,应根据实际改变情况进行再验证,从而保证所采用的分析方法能够控制药品的内在质量。 方法再验证的目的 判断变更发生后，对应的分析法方法是否科学、