基因工程复习资料U版样本

1、名词解释10*2是非10*2选择10*2简答5*5论述1*15 18日14:00-16:00教 2101基因工程：是指核酸分子经体外加工，将不同来源的基因按照设计组成新的基 因组，再把它引入宿主细胞中，使之表示的技术。简单地能够归结为：经过体外 基因操作，引起生物遗传性状改变的技术。基因工程应用在植物方面的就称为植 物基因工程。载体：把一个有用的目的基因DNA片段经过重组DNA技术，送进受体细胞中去进 行繁殖和表示的工具叫载体。当前使用的载体主要有四大类：质粒，噬菌体入、 单链噬菌体和粘粒。质粒的拷贝数：指质粒在复制时与宿主的繁殖相结合，致使每个细胞中只有一 个或几个质粒，质粒在细胞中的拷贝数

2、为10200个。转化：是指将外源DNA引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它 是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。感受态细胞：是指具有吸收裸DNA分子能力的细胞，一般经一系列的处理方式 可使得细胞膜的通透性发生改变，而使细胞成为感受态细胞。受体细胞：是指转化的对象，接受重组DNA的细胞，一般要求有高转化率，能 保持质粒稳定，属某营养缺陷型，具其它选择标记等条件。基因组文库：是指把某种细胞的整个基因组DNA,按一定长短要求，酶解成若 干片段，在与合适的载体分子重组，引入相应细胞，形成一大批含重组DNA分 子的细胞克隆群体，该克隆群体即为基因组文库。cDNA文库：是指以

3、生物体的RNA（一般是mRNA）为模板，经反转录形成cDNA分子, 予以克隆形成的一种基因文库。S-D序列：细菌mRNA翻译起点上游与16SrRNA相结合的序列。退火：是指PCR等核酸分子重组过程中，即DNA加热变性后逐渐冷却的过程，在 分子遗传中，应用于不同来源的核酸分子形成杂合体的研究中。转化外源基因的稳定表示:是指外源基因整合到核基因组DNA分子上，并能稳定 遗传的外源基因的表示。分子标记:可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白。包括蛋白质标记和DNA标记。转座子基因工程的研究内容1、特定目的基因的分离或合成2 .构建重组DNA分子转化宿主细胞筛选重组DNA菌落目的基因的有效表示基因工程的基

4、本操作程序主要包括五个方面的内容：1带有目的基因的DNA片段的制备、DNA片段与载体DNA体外重组2、DNA重组体转入受体细胞3、4重组体克隆的筛选与鉴定4、5外源基因的表示、制备外源DNA片段能够有以下5个途径：第一从生物基因组群体中分离目的基因（鸟枪法即限制性内切酶法、反转录第 ，法）第二，人工合成第三，PCR反应合成DNA第四 mRNA差异显示法获得目的基因第四，第五机械的方法如超声波把基因组打成片段。第五，工具酶：基因工程中进行基因的剪切、拼接、组合所需的酶统称为工具酶工具酶按功能分为剪切酶、修饰酶、连接酶限制性内切酶的特点：只降解双链DNA分子，而不切单链DNA,反应时需金属Mg2+

5、离子等。影响限制性内切酶活性的主要因素:1酶的纯度 .4.酶切反应的温度与时间2 DNA样品的纯度 2.5.DNA分子的构型3 DNA的甲基化程度 3.6.反应缓冲液常见的聚合酶有三种：即依赖DNA的DNA聚合酶；依赖RNA的DNA聚合酶；依赖DNA的RNA聚合酶。理想的基因工程载体的要求:1.能在受体细胞中独立繁殖4.分子量小，多拷贝易于分离、纯2.容易导入受体细胞化、导入有限制性内切酶位点5.有容易识别的筛选标记,载体的种类：质粒、噬菌体、病毒、粘粒质粒的三种构型：共价闭合环状DNA( cccDNA)、开环DNA( ocDNA)、线形DNA( LDNA) 质粒空间构型与电泳速率：同一质粒尽

6、管分子量相同，不同的构型电泳迁移率 不同 电泳顺序(快到慢)1 SC 2L 3 OC为什么要质粒质粒载体的构建?1、天然质粒的局限性分子量大，拷贝数低筛选标志不理想质粒载体必须具备的基本条件(1)具有复制起点(ORI)(4)具有较小的分子质量和较高的拷(2)具有抗菌素抗性基因贝数若干限制性内切酶的单一位点质粒载体是以PBR322为基础进行构建的PBR322的优点1）双抗菌素抗性选择标记没有获得载体的寄主细胞，在Amp或Tet中都死亡获得载体的寄主细胞，在Amp或Tet其中之一中死亡2）分子小，克隆能力大载体越小越好，大于10kb的DNA在纯化过程中容易断裂3）高拷贝数4）安全粘粒载体的特点：具

7、有l噬菌体的特性，在寄主细胞内形成环化DNA具有质粒载体的特性，能象质粒一样复制。方便的选择高容量的克隆能力大分子DNA克隆载体：一、酵母人工染色体YACYAC载体的基因结构 着丝粒区（CEN）主管染色体在细胞分裂过程中正确地分配到子细胞 中 端粒（TEL）对于染色体的稳定及端粒复制具有重要意义 复制起点（ORI）YAC可容纳更长的DNA片段，用较少的克隆就能够包含特定的基因组全部序列并 由此保持基因特定的完整性，有利于制作物理图谱。构建时在细菌中操作。细菌人工染色体（BAC）是以细菌F因子为基础构建的细菌克隆载体。F质粒的特点：1）单拷贝复制2）克隆容量可达300kb3）比较稳定4）便于提纯

8、核酸的提取与纯化的三大步骤:1细胞破碎 2去除与核酸结合的蛋白质及多糖脂等杂质，3除去其它杂质核酸CTAB法是种去污剂,可溶解细胞膜，与核酸结合形成复合物,在高盐溶液中可溶， 低盐浓度时可沉淀，经过离心将CTAB与核酸的复合物同蛋白质多糖类物质分开, 然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀,CTAB 溶于乙醇.SDS法的基本原理：利用高浓度SDS在较高温度（ 55-65C）条件下裂解细胞， 使染色体离析、蛋白质变性，释放出核酸，然后用提高盐浓度及降低温度的做 法使蛋白质及多糖沉淀（一般是加入5M的乙酸钾于冰上保温，在低温条件下乙 酸钾与蛋白质及多糖结合成不溶物）。

9、离心除去沉淀后，对上清液中的核酸进行 重复抽提去除蛋白质，用乙醇沉淀水相中的核酸。方法：CTAB法、异硫氢酸胍、Trizol法RNA提取的关键因素是尽量减少的污染。并设法抑制RNA酶的活性。 污染来源：所有的器皿、所用的溶液、实验人员的手及飞沫。核酸的凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳的区别：聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高聚丙烯酰胺凝胶比琼脂糖凝胶的载样量大，聚丙烯酰胺凝胶回收的DNA样品纯度极高可用于要求非常严格的试验在聚丙烯酰胺凝胶分子的交联网状结构中，带有酰胺侧链的C-C聚合物不带 或少带离子侧链基团聚丙烯酰胺凝胶无色透明，比琼脂糖凝胶的紫外线吸收

10、率低，抗腐蚀性强， 机械强度高，韧性好影响凝胶电泳的因素：酶切效果即DNA分子大小：分子量大的，DNA迁移率小DNA分子构象：线性分子与环状DNA分子的迁移率不同DNA分子所带的电荷数：所带电荷数多，迁移快缓冲液的极性所采用电压的大小染色剂的添加量凝胶的浓度和厚度Southern印迹杂交：DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用 探针进行检测的方法。Northern印迹杂交：检测RNA（主要是mRNA）的方法与Southern杂交的不同_靶核酸：RNA_ RNA电泳_转膜：不需变性Western杂交印迹法：检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相 载体上，用特异的抗血

11、清对蛋白质进行鉴定及定量的方法。探针：指经放射性或非放射性等物质标记的已知或特定的DNA或RNA序列。根据探针的来源及核酸性质不同：DNA探针、RNA探针、cDNA探针，及寡核苷 酸探针探针的标记方法：（1） DNA缺口平移法（2） DNA随机引物法（3）聚合酶链反应标记法 构建基因文库所使用的载体主要有：入噬菌体、粘粒（菌落）、质粒、酵母人 工染色体基因组文库与cDNA文库的区别：从定义上看，基因组文库指某种细胞内的某个基因组按一定长短要求被酶 切成若干片段，与合适的载体分子重组，引入相应的细胞，形成的一大批含 DNA重组体的细胞克隆群体，这样的细胞克隆群体称为基因组文库cDNA文库指以生物

12、体RNA 一般是mRNA为模板，经逆转录酶作用形成cDNA 再予以克隆而形成的一种基因文库。就真核生物的基因而言，mRNA前体经加工，去除内含子，且加尾polyA成 为成熟mRNA,故cDNA文库与基因组文库对照可用于研究内含子在基因中的位置 及功能。PCR的原理：PCR是指聚合酶链式反应，又称体外的基因扩增。其原理是在一种 高温DNA聚合酶的作用下经过引物的模板DNA的作用来扩增DNA。模板能够是基 因组D NA,单链D NA,克隆的D NA序列或RNA（经过反转录成cDNA）。PCR的三个基本反应步骤:变性一退火一延伸模板DNA的变性：加热变性，使DNA双链解离为单链，以便它与引物结合， 为下轮反应作准