各种酶固定方法

1、、D380（功能基团为伯氨基）为载体戊二醒交联固定化淀粉酶1、固定化载体的预处理吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸馏水交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中 性备用；离子交换树脂先用蒸馆水漫泡胀润、去杂，然后用HCl、NaOH交替处理，最后用蒸锢水冲洗至中性，置于4 C冰箱保存备 用。2、载体选择取处理后载体（湿态）约1.0g，分别加入20mL酶液摇匀，在摇床上 室温（25C摄氏度），100r/min振摇，过夜（12h），弃去上清，并以磷 酸缓冲液反复洗涤至洗涤液中无蛋白检出。分别测定固定化酶和上清 液的酶活，并计算固定化得率。根据其酶活和得率进行筛选。3、固定化条件的优化取处理后载体（湿态）1.0g左右，加

2、入一定量戊二醒，在摇床上定温（25C） , 100r/min振摇一定时间，弃去上清，蒸馏水反复冲洗至无 戊二醛残留。处理后加入酶液进行固定化，条件同载体选择。4、蛋白质含量测定采用Bradford的方法，以牛血清蛋白为标准曲线。5、酶活收率指实际测定的总的固定化酶活与固定化时所用的全部游离酶活之比。6、酶活测定以20.0mL的2%可溶性淀粉为底物，加入5.0mL的缓冲液。在60 C预热5min后加入适量固定化酶或稀释至适当浓度的酶液，准 确反应5min后，立即取出1.0mL反应液置于稀腆液5.0mL中摇匀 显色。以稀腆液为空白，于660nm波长下测定其吸光度值。二、D301树脂固定化假丝酵母脂

3、肪酶1、固定化载体及其预处理选择7种工业应用广泛的吸附和离子交换树脂：D301、D113、AB-8、 D3520、D4020、D290、D280,购自南开大学化工厂。其中D301为大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，D113为大孔弱酸性丙烯酸系 阳离子交换树脂，AB-8、D3520和D4020为大孔吸附树脂，D290 和D280为大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。大孔吸附树脂： 采用乙醇、丙酮、蒸馏水交替处理，最后用蒸馏水冲洗至中性备用； 阳离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后，用2%-4% NaOH浸泡 4-8h后用水洗至中性，再用5%盐酸浸泡4-8h，用水洗至pH=6,待用; 阴离子交换树

4、脂:将树脂用水洗至流出清水后，用5%盐酸浸泡4-8h 后,用水洗至pH=6,再用2%4%NaOH浸泡48h,用水洗至pH 7-9, 待用。2、脂肪酶的固定化采用单因素对比试验分别进行载体选择、5%戊二醛溶液的加入量、酶 液浓度、pH环境和反应时间等条件的优化试验。称取一定量脂肪酶 粉溶解于100 mL设定pH值的磷酸缓冲液中，并倒入250 mL具 塞三角烧瓶中，再加入设定量的载体，在5 C-8 C低温冷却液循环 泵中，搅拌器搅拌反应24h。过滤,测定上清液的蛋白质含量。抽滤分 离固体和上清液，并用同种缓冲液清洗该固定化酶，自然风干，收集后 保存待用。三、D380树脂固定果糖基转移酶1、树脂的预

5、处理吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸榴水交替处理，最后用蒸惰水冲洗至中 性备用;离子交换树脂先用蒸馆水浸泡胀润、去杂，然后用4% HCl、 4% NaOH交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中性，置于4C冰箱保存 备用。2、游离果糖转移酶提取方法黑曲霉AS0023细胞的制备见参考文献12J。称取一定量黑曲霉细 胞放入烧杯中，加入适量的0.05moI/ L， pH5.0的拧棱酸一磷酸 缓冲液，在冰浴环境中用超声坡细胞破碎仪处理一定时间后，于4C 下冷冻离心(10000 * g) 20min，收集上清液在4C条件下进行超 滤以提高单位酶活，压力0.15MPa，截留相对分子质量10000，粗 酶提取液放入冰箱保藏

6、备用。3、果糖转移酶的固定化方法用滤纸吸干温树脂表面的水后称取0.5g于三角瓶中，加入一定量的 酶液，在所需的pH下在恒温水浴振荡器中缓慢振荡吸附一定时间 后，加入一定量的戊二醒进行交联。交联完成后，弃去上清，用缓冲 洛液冲洗戊二醒残留及未固定上的游离酶，所得固定化酶用缓冲液漫 泡待用。4、酶活测定方法游离果糖基转移酶活测定:一定体积底物浓度为10% (w/v )0.05moI/ L、pH5.0的拧穰酸-磷酸缓冲液于直径50mm， 100mL的恒温夹 套酶反应器中，50C下恒温搅拌反应1h，于1弗水中煮沸lOmin 终止反应。5、惰组分测定方法采用HPLC(高效液相色谱)法。HPLC , Wa

7、ters 209系列，配有 R401示差折光检测器和M740数据处理器;色谱柱：Hewlett Packard 公司 APS Hypersil 4.6 * 100mm 填料密度 5p m;流动相： 乙睛/水75/25，流速1mLl min;强度28 C;进样量：10p L。6、酶活力定义每分钟产生卬mol在果三糖(1-kestose )为一个酶活力单位。酶 用量为2U/g蔗糖。固定化酶活测定方法同游离果糖基转移酶活的 测定方法。固定化酶活回收率:酶活回收率定义为固定化酶活与所添 加的总酶活的比值。四、Burkholderic cepecia 1003 产海因酶固定1、海因酶的制备将由本实验室的

8、一株Burkholderic c叩ecia 10.03菌株发酵产酶 经过细胞破碎、硫酸镣沉淀、疏水层析和离子交换层析等步骤后得到 经初步纯化的海因酶酶液。蛋白质量浓度为1. 2mg/mL，于-2.0C 下保存备用。2、Eupergit C 和 Eupergit C 的氨基化分别称取5 g Eupergit C和Eupergit勺飒干树脂，于密闭容器 内，45 C下分别用4.0 mL 2.5%的NH3 H20浸泡.48 h，以去 离子水反复淋洗至中性。以pH 6.5 , 0.1 mol/L的磷酸缓冲平衡氨 基化后的树脂，于4 C下保存备用。3、EDC溶液的配置称取 0.785 g EDC(碳化二

9、亚胶(N 一( dimethyl-aminopropyl)- N -ethylcarbodiimide)，加入 5 mL MnC1 2 水溶液(1 mmol/L) 中，用1%HCl调节pH值至5.0，定容至12 mL。4、环氧基载体上海因酶的固定化酶液用0.1 mol/L的一定pH值的缓冲液稀释，取出2mL分别加人 0.2 g的环氧基载体Eupergit C和Eupergit C湿树脂。4C 下水平轻微振荡后，用pH 8.5, 0.1 mol/L的Tris - HCl缓冲滤 洗，4C下至少保存48 h后方可使用。5、氨基载体上海因酶的固定化酶液用0.1 mol/L的一定pH值的缓冲液稀释，取出

10、2 mL分别加 入 0.2 g 的氨基载体 Eupergit C ( -NH2)和 Eupergit 七风(-NH?) 湿树脂，冰浴条件下手动振荡滴加EDC溶液，4 C下悬空振荡。反 应结束后，需用含0. 5 mol/L NaCl的pH 8.5 , 0.1 mol/L的 Tris-HCl缓冲反复淋洗3次，最后用pH 8. 5 , 0.1 moVL的Tris -HCl缓冲滤洗后4C保存。五、黑曲霉果胶酯酶固定化1、游离酶活力的测定J用pH - stat法（Z. 1. Kerte钮，1937 ）测定果胶醋酶的活力。 取100mL质量分数为0.5%的柑桶果胶溶液于40 C下恒温，用 O.lmol/L

11、的NaOH将pH调到4.4,加入lmL酶液（稀释10倍）， 同时开始记时。果胶醋酶催化果胶水解，使体系的pH不断下降，利 用自动滴定仪不断滴人O.lmol/L的NaOH，使体系pH始终保持在 4.4。每隔lmin记1次NaOH的消耗量，反应5min ，以加人的 NaOH的微摩尔数一反应时间作图，由所得直线的斜率计算果胶醋酶 的活力。1个酶活单位：40 C下，每分钟生成的酸的微摩尔数，即 PE活力单位是以mol/min。2、固定化酶活力的测定J用pH - stat法（Z. 1. Kertesz ,1937）测定果胶醋酶的活力。取100mL质量分数为0.5%的柑情果胶溶液于45 C下恒温，用 O.

12、lmol/L的NaOH将pH调到固定化果胶醋酶的最适pH（明胶固 定化果胶醋酶为4.0、蛋壳固定化果胶醋酶为4.2），加人一定量 的固定化果胶醋酶（明胶固定化果胶醋酶为8g、蛋壳固定化果胶醋 酶为1g），同时开始记时，果胶醋酶催化果胶水解，使体系的pH不 断下降，利用自动滴定仪不断滴人O.lmol/L的NaOH，使体系pH始 终保持在固定化果胶醋酶的最适pH。每隔lmin记1次NaOH的 消耗量，反应5min，以加人的NaOH的微摩尔数反应时间作图，由 所得直线的斜率计算果胶醋酶的活力。1个酶活单位：45 C下，每 分钟生成的酸的微摩尔数，即PE活力单位是以mol/min。3、固定化酶的制作方法蛋壳固定化酶的制作方法蛋壳的预处理取用水浸泡了一段时间的蛋壳，揭除内层薄膜，研成小片。用去离子 水彻底清洗后，用蒸馆水洗涤，再用丙酣溶液洗涤，所得蛋壳碎片于 干燥箱内60 C干燥数小时，研成小颗粒，待用。蛋壳的酸处理称取与预处理好的蛋壳于100mL烧杯中，向其中缓慢加人50mL pH = 1. 0的拧攘酸，以缓解蛋壳的强碱性质，拧攘酸处理24h，最终 pH =4