蛋白质定量比活性介绍km值测定

1、蛋白质定量方法比活性介绍Km测定By 邹宸 高漫辰邹运刘伟凯氏定氮法原理：食品与硫酸和催化剂一同加热 分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵 碱化蒸馏使氨游离 用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准溶液滴定反应步骤：1、有机物中的胺根在强热和CuSO4、浓H2SO4 作用下硝化生成（NH4）2SO42、与碱作用 蒸馏释放出NH3 收集于H3BO3 溶液中3、用已知浓度的酸标准溶液滴定注意事项：计算所得结果为样品总氮量 如欲求得 样品中蛋白含量 应将总氮量减去非蛋白氮即得非蛋白氮可用三氯乙酸沉淀分离凯氏定氮法缺点灵敏度低（适用于0.2 1.0mg氮）费时太长（810小时)易受非蛋白氮干扰双缩脲法原理：双缩脲反应：双

2、缩脲与CuSO4在强碱性溶液中形成紫色络合物蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似也能与Cu2+形成紫红色络合物紫色络合物颜色深浅与蛋白质浓度成正比与蛋白质分子量及氨基酸成分无关于540nm处进行比色测定 可得蛋白质含量双缩脲试剂： 1.50克硫酸铜+ 6.0克酒石酸钾钠+ 300毫升10% NaOH溶液，定容至1升双缩脲法操作步骤取12支试管分两组 分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液用水补足到1毫升分别加入4毫升双缩脲试剂第一支试管作空白组，于540nm处进行比色测定绘制标准曲线双缩脲法优缺点优点：较快速（2030分）、干扰物质少缺点：灵敏度差（范围为110m

3、g蛋白质）双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质测定Folin酚试剂法原理：蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合 形成蛋白质一铜复合物此复合物使酚试剂的磷钼酸还原 产生蓝色化合物利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系 作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度主要试剂试剂甲：(1)4碳酸钠(Na2CO3)溶液 (2)0.2N氢氧化钠溶液 (3)1硫酸铜溶液(CuSO45H2O) (4)2酒石酸钾钠溶液(或酒石酸钾或钠)试剂乙：磷钼酸-磷钨酸混合液实验步骤试剂甲使蛋白质发生烯醇化反应 在碱性条件下形成蛋白质-铜络合物试剂乙使钨酸、钼酸两者同时失去氧原子 还原形成特殊的蓝色于700nm处测定各管中

4、溶液的吸光度值绘制出标准曲线注意事项Lowry反应的显色随时间不断加深 因此各项操作必须精确控制时间显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化 因而此法通常适用于测定蛋白质相对浓度优缺点优点：灵敏度高（5mg）缺点：易受干扰（硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、各种硫醇）、操作较严格紫外吸收法原理：蛋白质中的共轭双键对紫外光有吸收作用其最大值在280nm波长处蛋白质溶液的光吸收值与其含量成正比 实验步骤将已知不同浓度的蛋白质标准溶液在280nm处测定作标准曲线 即可求得未知溶液的蛋白质浓度优缺点优点：简便、灵敏、快速 不消耗样品 测定後能回收使用缺点：易被核酸干扰考马斯亮蓝法（bradford法）原理：考

5、马斯亮蓝G-250在酸性溶液中与蛋白质结合后变为蓝色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。 考马斯亮蓝法（bradford法）注意：该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。步骤：1Bradford浓染液的配制：2标准曲线蛋白质样本的准备：3将待测样本溶于缓冲溶液中；4用蒸馏水稀释浓染料结合溶液；5每个样本与染料结合溶液，测定其吸光度。6根据标准曲线计算待测样本的浓度。 考马斯亮蓝法（bradford法）优点： 1、灵敏度高 2、快速简便 3、干扰物质少缺点： 1、用于不同蛋白测定有较大偏差

6、 2、仍有些物质干扰 3、也有轻微的非线性二喹啉甲酸（BCA）法原理： 碱性溶液中，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，再与BCA生成蓝紫色复合物，在波长562nm有最大吸收，强度正比于蛋白质浓度。优点： BCA检测法提高了蛋白检测灵敏度和特异性，消除了核酸的干扰，核酸干扰在对细胞裂解物或其他生物样品进行蛋白定量时总是一个难以避免的干扰。BCA（bicinchoninic acid ）法 这是近几年兴起的一种新的测定蛋白质的方法，现已报道络天青S、次氯酸盐-硫胺素及蛋白蓝670法测定蛋白质的 方法，其灵敏度较低。荧光法金属离子-染料结合法 金属离子-染料和蛋白质在适宜条件下反应进而检测蛋白质。例如钛

7、-4,5-二溴基荧光铜-tween-80与蛋白质的显色反应来测定微量尿蛋白。免疫学方法免疫扩散发法琼脂糖免疫电泳法毛细管电泳免疫法比活性介绍 邹运 3097119049每个质量单位所含活性单位的数目。如每毫克蛋白质所含酶单位数， 每千克蛋白质所含开特数， 每微摩尔所含微居里数。比活性（SA）1标记分子中标记放射性的相对强度或非放射性标记物(如酶标记物)相对活性的表示方法。一般以单位质量所含放射性核素量(如d/m、Bq 或所测得的放射性记数率)或酶的活性单位(如 U)等表示。 比活性（SA）2Concept酶的比活性：用每毫克蛋白所具有的酶活性来表示。酶活性单位：根据国际酶学委员会规定：在特定情

8、况下，1min 使1mol底物转变所需的酶量，称为一个酶活性单位。 每毫升样品中蛋白质的毫克数；每毫升样品中酶活性 单位数。酶的比活性Concept磷酸苯二钠法：选用不同浓度的磷酸苯二钠为底物，在AKP的 作用下。磷酸苯二钠产生游离苯酚和磷酸盐。苯酚在碱性条件 下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化可生成红色醌类复 合物。 用分光光度法测量酶活性。一、AKP酶活性的测量+ H2OAKP+K3Fe(CN)6碱性条件磷酸苯二钠苯酚苯酚4-氨基安替比林醌类衍生物（红色）如书本P129表4-1操作。室温后10min，在分光光度计510nm处以空白管校正吸光度值为零。各管酶活性单位（U/ml）=测定管

9、A510/标准管A510*0.07*稀释倍数紫外分光光度法：蛋白质分子通常含色氨酸和酪氨酸，在波长 280 nm有最大吸收，可用经验公式计算蛋白质含量。二、蛋白质的定量测量经验公式蛋白质含量C（mg/ml）=（1.55A280-0.76A260）*稀释倍数AKP比活性单位（U/mg）=AKP比活性计算酶Km的测定Km的定义酶促反应达到最大速度一半时底物的浓度测定Km的一种方法：双倒数法SVVmax当反应速度为最大反应速度一半时Km值的推导KmS Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。2Km + S Vmax VmaxSVmaxVSKmVmax/2 双倒数作图法

10、(double reciprocal plot)，又称为 林-贝氏(Lineweaver- Burk)作图法 VmaxS Km+SV = （林贝氏方程） + 1/V=KmVmax 1/Vmax 1/S 两边同取倒数 测定Km过程中条件的控制酶Km测定条件的选择和限定引言中已强调：仅在一定条件下酶反应速度v才和酶量成正比一定条件是什么？国际临床化学联合会（ifcc）和不少国家包括我国的一些学会建立了或正在建立测定酶活性浓度的推荐或参考方法。都毫无例外地提出测酶活性浓度方法所选择的测定条件应是酶反应的“最适条件”以保证酶具有最大的催化活性。我国检验学会文件中对最适条件是这样提出：选合适的底物、辅因

11、子、活化剂、变构剂的种类和浓度。指示酶和辅助酶的种类和浓度。反应混合液的最适ph，缓冲液种类和浓度。其它影响酶活性的因素，如去除各种抑制剂。一、底物、辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度这一项包括几种因子，其中最重要的是底物种类和浓度，这是每种测酶活性浓度方法中首先需要选择的项目，选择恰当与否，对该酶测定至关重要。后面几项则不是每种酶测定都会遇到的选择。二、辅因子、活化剂的种类和浓度从广义上说，凡能促进酶及反应物进入活化状态从而加速酶催化反应的物质都能称为辅因子如测定酶需要辅因子，活化剂时，应选择合适的种类和浓度加入到测定酶的体系中，在些过程中可能会涉及到四类物质首先是辅酶（coenzyme）。

12、很多酶反应都必须有辅酶参加第二是辅基，辅基虽也是小的有机化合物，但却是酶蛋白不可分割部分。不含辅基的酶蛋白称为脱辅基酶蛋白（apoenzyme），没有催化活性，必须加入足量辅基，和它结合成为全酶（holoenzyme），才可能有催化活性。第三类物质是离子，很多酶需要特定离子帮助才能使其反应达到最大速度。最常见的是二价金属离子如mg2+、zn2+、mn2+、ca2+、fe2+等。所有转移磷酸的酶，如激酶类和碱性磷酸酶的反应都需要mg2+的参加。所以如在反应体系中加入金属螯合剂如ed-ta或以他们为抗凝剂常抑制一些酶的活性第四类是一些无法包括在前三类的其它加速酶反应物质。如巯基化合物可稳定酶的双硫键。在肌酸激酶反应体系中加入它将明显增高酶活性，并且随所加巯基化合物的不同，增加的速度也有差异，所以在测肌酸激酶时要选择好巯基化合物的种类