实验操作指导书：小牛胸腺DNA熔解温度的测量

1、PAGE PAGE 206实验六 小牛胸腺DNA熔解温度的测量一、实验目的1. 了解DNA的变性性质，及其熔解温度的意义和用途。2. 掌握测量熔解温度的方法。二、实验原理当DNA暴露在变性环境（加热，有机溶液等）中时，其紫外吸收曲线就会显著改变。如下图所示，从25加热至80，光吸收变化很小，但是当温度继续上升时，紫外吸收急剧增加，然后趋向一个恒定的A260 值，这条曲线叫做DNA的熔解曲线，曲线中吸收增加的中点所对应的温度，定义为熔解温度（Tm）。大多数DNA的熔解温度都在80 90之间，光吸收通常增加40%。DNA分子中GC碱基对的含量越高，其双螺旋结构就越稳定，Tm也就越高；DNA样品中的

2、杂质越多，光吸收的增加也就越小。每种DNA分子都有其特有的 Tm，可以用于DNA的鉴定与特征分析。 DNA的熔解曲线 本实验将采用热变性的方法测量小牛胸腺DNA的熔解温度，有两种方法可供选择。 方法一：需要一台带有超级恒温水浴和恒温样品池架的分光光度计，其温度在25100之间可调，要使用高沸点溶剂（如乙二醇）作为循环液体。把装有DNA标准溶液的石英比色杯放入分光光度计的恒温样品池架中，按不同的温度间隔升高温度，平衡后，测量其260nm处的紫外吸收（A260）。要考虑到，在加热过程中，水体积增加会使DNA浓度降低。 另一种方法是，取一支装有DNA溶液的试管，测量其2 5时的A260。然后将几管装

3、有同样DNA溶液的试管在不同温度的恒温水浴中加热。15分钟后迅速将试管放在冰浴中冷却，然后迅速测量其A260。这种方法的主要缺点是变性DNA冷却后引起DNA双链的部分再结合，所以A260的增加一般只有1020%。三、器材与试剂 1. 紫外分光光度计2. 超级恒温水浴 3. 普通恒温水浴4. 石英比色杯（带盖）5. 冰浴桶6. 水浴锅7. 试管8. 缓冲液：0.015mol/L柠檬酸钠0.15mol/L氯化钠溶液9. DNA溶液：用实验五所得小牛胸腺DNA和缓冲液，配制A260= 0.4左右的DNA 标准溶液。溶解此DNA需较长时间的搅拌。四、操作步骤方法一：用超级恒温水浴测量Tm打开分光光度计

4、，予热20分钟，将超级恒温水浴的温度设为25，以测量起始的光吸收，将装有柠檬酸钠缓冲液的参照比色杯和装有标准DNA溶液的样品比色杯放入分光光度计的样品池架中的相应位置。放置3分钟，使比色杯内外的温度达到平衡，将此时的参照杯A260调为零，记下此时的DNA的样品的A260，这个测量要十分小心，因为所有测量值都要与25的这个值进行比较。然后，将温度升至50，取出比色杯，轻叩杯壁以去除内壁上的气泡。将比色杯放回样品池架，测量后继续加热至80，平衡5分钟后，记下其A260，再升高2，平衡5 分钟后记下其A260，重复此操作步骤至A260达到恒定值。可以注意到在一个510的温度范围内，A260有一个较大

5、幅度的增加。根据不同温度下水的体积变化对不同温度下的A260（即A260,T）进行补偿后，以A260,T / A260,25作纵轴，T作横轴，画出小牛胸腺DNA的熔解曲线，并求出Tm。方法二：用普通恒温水浴的方法测量Tm。将恒温水浴的温度分别设为50、70、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98和100，往15支试管中各加入标准DNA溶液3ml，盖上橡皮塞或包上塑料薄膜。100水浴锅中放两支，其余12个恒温浴中各放一支。剩下一支室温放置，并测量其A260，即为基准值A260,25。将100水浴锅中的一支试管，连同水浴锅一起在室温下缓慢冷却至室温，放置1小时后再测其A260。

6、其余试管均温浴15分钟后，取出迅速放入冰水中，冷却10分钟以上，由冰水中取出就立即测量A260，即为各A260,T。 紫外分光光度计要提前打开，调好零点，做好准备。用溶解DNA的缓冲液作参比。测完后，以A260,T/ A260,25为纵轴，T为横轴作图（去除100加热，室温下缓慢冷却的点），求出小牛胸腺DNA的Tm。（取曲线上直线部分延长线的交点之间的中点求出Tm。）五、思考问题1、DNA变性后，为什么会产生增色效应？2、予测并解释下列条件对天然DNA的Tm的影响。（1）pH=12的缓冲液（2）蒸馏水（3）50% 的甲醇（4）1% SDS0.15mol/L NaCll0.015mol/L柠檬酸钠（pH7.0）3、根据%GC=2.