动物组织细胞基因组DNA提取实验原理及步骤

1、实验六 动物组织细胞基因组DNA提取 一、实验原理 真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组 DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DN

2、A分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的 活性；而蛋白酶K可将 蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。二、仪器及试剂 1. 仪器： 恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌） 2. 试剂：（1）细胞裂解缓冲液：Tris (pH8.0) 100 mmol/LEDTA (pH 8.0) 500 mmol/LNaCL 20 mmol/LSDS 10%胰RNA酶 20ug/ml（2） 蛋白酶K： 称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20备用。（3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。（4）酚?

3、氯仿?异戊醇（25:24:1）、（5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。三、操作步骤1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20l，混匀。在65恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37水浴1224h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。2.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤

4、进行）3.加等量的酚?氯仿?异戊醇振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 4.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿?异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4或?C20保存备用。10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。四、常见问题1.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。2.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。3. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。4. 电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。5.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情况下，应加入S