可溶性固定化木瓜蛋白酶的制备及其性质研究

1、可溶性固定化木瓜蛋白酶的制备及其性质研究【摘要】目的制备一种可溶性固定化木瓜蛋白酶并对其局部酶学性质进展研究。方法将木瓜蛋白酶偶联在亲水性高分子聚合物羧甲基纤维素醋酸琥珀酸酯AS-L上制备得到水溶性固定化木瓜蛋白酶。在一样的条件下测定游离的木瓜蛋白酶和水溶性固定化木瓜蛋白酶的活力，得到两种状态的酶的最适作用pH值和最适作用温度，再于它们各自的最适条件下测定活力，得到各自的K值；在一样的条件下测定两种状态的酶的热稳定性、酸碱稳定性、低温稳定性和回收稳定性。结果游离木瓜蛋白酶和可溶性固定化木瓜蛋白酶的最适作用pH值分别为6.0和5.0，最适作用温度分别为60和70，K值分别为2.53、3.07gl

2、-1；可溶性固定化木瓜蛋白酶在60条件下，保温12h，仍有62%的活性；在4条件下，30d后活性保存达90%以上；在pH6.0时稳定性最好，在pH4.07.0范围内也比拟稳定相对活性80%。结论可溶性固定化木瓜蛋白酶可以在pH5.5以上的溶液中完全溶解，最适作用pH值范围变窄，最适作用温度和K值升高；热稳定性和酸碱稳定性均明显增强。【关键词】可溶性固定化酶；木瓜蛋白酶；酶学性质Abstrat：bjetiveTprepareaslubleibilizedpapainanddeterineitsenzyatiprperties.ethdsTheslubleibilizedpapainasbtain

3、edbynjugatingthepapainiththehydrphilihighleularplyerarbxylethylellulseaetisuinate.Underthesaenditin,theativitiesfibilizedandslublepapainseredeterinedtnludethEirptiupHandteperature,thenundertheserespetiveptiunditins,thEIrativitieseredeterinedtnludetheirKvalue.Atthesaetie,thetherdynaistability,theaid-

4、basestability,thelteperaturestabilityandtheperatinalstabilityererespetivelydeteted.ResultsTheptiunpHvaluesfslubleandibilizedpapainere6.0and5.0.Theirptiuteperatureere60and70.TheirKvaluesere2.53and3.07gl-1.Under60,after12hurstherelativeativityfibilizedpapainas62%.Under4,after30daystherelativeativityas

5、stillver90%.UnderthepH6.0,after72hurstheativityfibilizedpapaindidntderease,andbeteeenpH4.0and7.0itsstabilityashigh(relativeativityasver80%).nlusinSlubleibilizedpapainanfullyslubilizeabvethepH5.5.TheptiupHrangefpapainasnarr,anditsptiuteperatureandKvalueereallhigherthanbefre.Itstherdynatistabilityandt

6、heaid-basestabilityerealsstrengthened.Keyrds：Slubleibilizedenzye;papain;enzyatiprperty木瓜蛋白酶E3.4.22.2是一种重要的生化试剂。木瓜蛋白酶具有稳定性好、水解催化活性高等特点，使其在食品、医药、纺织等工业消费中有着广泛的用处。近年来关于固定化木瓜蛋白酶的报道较多，但是研究主要集中在制备不溶性的固定化酶1,2,3。传统方法制备得到的不溶性固定化酶具有稳定性好和回收方便等优点，但是在面对难溶性底物和高粘度底物溶液时，应用却大大受限，催化效率低下。为此，本文将木瓜蛋白酶通过共价键固定在亲水性高分子载体ASL上

7、，制备得到了可以溶解于反响体系的可溶性固定化木瓜蛋白酶，通过游离酶和固定化酶假设干性质的比拟，为可溶性固定化木瓜蛋白酶在医药消费中的应用建立了技术基矗1材料与方法成1.1材料木瓜蛋白酶Sigaa公司，羧甲基纤维素醋酸琥珀酸酯AS-L，日本信越株式会社，1乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺ED，上海东风生物技术，牛血清白蛋白成都科龙化工试剂厂，考马氏亮兰G250上海东风生化试剂公司，壳聚糖上海伯奥生物科技，脱乙酰度90。其余试剂均为分析纯。1.2方法1.2.1蛋白质含量测定参考文献方法4，采用Bradfrd法。1.2.2木瓜蛋白酶活力测定参考文献方法5，1个酶活力单位U定义为40时，单位时

8、间内水解1g牛血清白蛋白所需要的酶量。1.2.3可溶性固定化酶SIP的制备参考文献方法6，在磁力搅拌下向20l木瓜蛋白酶溶液500g/l,pH6.06.5中滴参加一定量的10ED溶液和AS-L溶液，1015温度下反响一段时间后，调节溶液pH4.0左右，离心搜集沉淀，用柠檬酸钠缓冲液0.02，pH4.0洗涤后，离心搜集沉淀。沉淀溶于PBS缓冲液0.02，pH6.0，定容至100l即得SIP溶液。1.2.4可溶性固定化木瓜蛋白酶SIP的酸碱溶解性调节SIP溶液pH，3000rp离心后搜集上清液，测定其溶液280n处吸光度值，计算其相对溶解度。1.2.5可溶性固定化木瓜蛋白酶SIP的催化特性1.2.

9、5.1最适作用pH值分别取一定量游离木瓜蛋白酶溶液100g/l，pH6.0和SIP溶液，参加到5.0lpH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0等6种不同pH的缓冲溶液0.2中，40测定其活力，计算游离木瓜蛋白酶和SIP在各种pH条件下的相对活力。1.2.5.2最适作用温度分别取一定量上述两种酶液，在30、40、50、60、70、80、90温度下，测定其活力，计算两者在各个温度下的相对活力。1.2.5.3K值取上述两种酶液，在最适反响条件下，测定不同浓度的酶活力，可溶性胰蛋白酶的测定条件一样，作双倒数图，计算K值。1.2.6可溶性固定化木瓜蛋白酶SIP的稳定性1.2.6.1热稳定性

10、取上述两种酶液，在PBS缓冲液中，60下分别保温1h、2h、4h、6h、8h、12h、，测定各个时间段的酶活性，以0h的酶活性为100%，计算各个时间段的相对活性。1.2.6.2酸碱稳定性称取一定量木瓜蛋白酶和SIP，置于不同的pH的缓冲液4.09.0中，4下保存72h，测定各个pH下的酶活性，以保存前pH6.0酶溶液的酶活性为100%，计算各个pH下酶的相对活性。转贴于论文联盟.ll.1.2.6.3低温稳定性将上述SIP酶液置于4的冰箱中储存，分别于0d、5d、15d、20d、25d、30d测定其活性，以0d的酶活性为100%，计算不同时间的相对酶活性。1.2.6.4操作稳定性将SIP溶液按

11、1.4进展10次沉淀、溶解的回收操作，测定每次SIP溶解后的溶液总酶活力。分别以固定化操作前总酶活力为100，计算每次的酶活力回收率。2结果2.1可溶性固定化木瓜蛋白酶SIP的酸碱溶解性如图1，结果说明SIP在pH5.0以上可以完全溶解，在pH4.0左右根本不能溶解。利用此性质，可以使SIP在最适反响pH条件下处于溶解状态，使整个反响体系为均相，可以大大进步催化反响效率。同时利用调节pH的方式可以方便的对其进展回收。2.2可溶性固定化木瓜蛋白酶SIP的催化特性2.2.1最适作用pH值结果见图2，游离木瓜蛋白酶的最适作用pH为6.0，而可溶性固定化木瓜蛋白酶那么是pH5.0。且从图上可以看出，p

12、H偏酸时，可溶性固定化酶的活力明显要高于游离酶。这主要是因为木瓜蛋白酶受到固定化载体ASL上大量负电荷的影响，使得酶反响的表现pH向酸性方向挪动，使得可溶性固定化木瓜蛋白酶在低pH下表现出较强的催化活性。2.2.2最适作用温度结果见图3，游离木瓜蛋白酶的最适作用温度为60，而可溶性固定化木瓜蛋白酶那么是70。且从图上可以看出，温度超过最适作用温度时，可溶性固定化木瓜蛋白酶活力降低速度明显要低于游离酶，这主要是大分子载体的保护作用。2.2.3K值结果见图4，可溶性固定化木瓜蛋白酶的K值为3.07g/l，而游离酶那么为2.53g/l。两者很接近，显示可溶性固定化木瓜蛋白酶的催化作用较难溶性固定化酶

13、更加接近游离酶。2.3可溶性固定化木瓜蛋白酶SIP的稳定性2.3.1热稳定性结果见图5，可知可溶性固定化木瓜蛋白酶的热稳定性要优于游离酶，60保温12h后仍然有62的活性。2.3.2酸碱稳定性结果见图6，可知可溶性固定化木瓜蛋白酶的酸碱稳定性优于游离酶。它与传统难溶性固定化酶的不同在于，两者变化曲线类似，均在pH6.0处最为稳定，这可能是因为两者溶解于缓冲液中，酶分子可以充分接触缓冲液使得两者的变化曲线类似，但是由于载体大分子的保护作用，可溶性固定化木瓜蛋白酶对pH变化的适应性较强，在pH4.07.0范围内较为稳定。2.3.3低温稳定性结果见图7，可溶性固定化木瓜蛋白酶有较好的低温稳定性。30

14、d活性保存95。2.3.4回收稳定性结果见图8，可溶性固定化木瓜蛋白酶有着较好的操作稳定性。在制备后第1次回收即第2次离心溶解时，活力会显著下降，这可能是因为一些游离酶没有通过共价键与载体相连，而是吸附或者包裹在载体中了，沉淀溶解操作时脱离载体进入上清液的原因。3讨论在反响中使用游离酶导致产品易污染且酶难以重复使用，因此开展了固定化酶技术。传统的固定化酶是将游离酶通过物理或化学方法固定在难溶性载体上制得。这种固定化酶几乎不溶于反响体系，在工业上，能实现酶的反复利用和酶、原料、产物三者间的有效别离，从而简化别离工艺及设备，缩短消费周期，降低消费本钱。但是同时由于其不溶于反响体系，使得酶催化反响仅

15、限于固定化酶与底物溶液的接触面上，形成非均相反响，导致固定化酶的催化效率远远低于游离酶。如今有报道提出了柔性固定化酶和定向固定化的概念3,7，可以进步难溶性固定化酶制备时的活力回收和催化活性，但是面对难溶性底物或者底物溶液粘度等情况时，难溶性的固定化酶应用仍然受到极大限制。在催化效率方面，本研究制备得到的可溶性固定化酶接近于游离酶。因其可以在反响体系最适pH下处于溶解状态，使得整个反响体系处于均相体系，酶与底物接触几率较固液两相反响体系大大进步。同时由于处于液体溶解状态，载体上的酶可以自由旋转，活性中心可以充分暴露，也增加了酶的催化效率。因此，可溶性固定化酶的催化效率优于传统的难溶性固定化酶。

16、在稳定性方面，本研究制备得到的可溶性固定化酶接近于难溶性固定化酶。因为酶与大分子载体相连后，处于大分子载体的屏蔽保护下，其稳定性较游离酶仍然大大进步了。在回收操作方面，可溶性固定化木瓜蛋白酶可以通过调节溶液pH而回收，一般的水解产物小分子不会因此沉淀，因此其回收操作也较为方便。总的来说，可溶性固定化木瓜蛋白酶兼具游离木瓜蛋白酶高催化活性和难溶性固定化酶高稳定及便于回收的特点，在工业应用上有着广阔的前景。【参考文献】1王海英，林洪，叶眉，等.固定化木瓜蛋白酶的研究及其应用J.青岛海洋大学学报,2001,31(5):689-694.2欧伶，翁清清，宋聿文，等.固定化木瓜蛋白酶的制备及性质J.华东理工大学学报,1997,23(1):49-5