液相色谱故障判断分析

1、液相色谱故障判断分析时间：2010年11月色谱培训讲义E-mail:色谱技术QQ群：19295477能引起HPLC发生问题的潜在因素:工作环境 电源及地线流动相 泵进样器 保护柱在线过滤器连接管路色谱柱检测器数据处理装置 操作基线问题分析基线噪声流动相内含有空气 - 脱气处理检测池内有气泡 - 冲洗检测池色谱柱内有未洗脱尽的组份 - 洗脱色谱柱. 系统有漏液之处 - 检漏并处理电噪声 - 去除噪声源, 信号线屏蔽, 检查系统接地状况检测器光源灯能量低 - 更换光源灯检测池污染 - 冲洗检测池基线噪声基线噪声基线周期性噪声绝大多数情况下是来源于泵的问题泵头内有气泡 - 流动相脱气 ,泵头排气(注

2、意正确的排气方法)泵进出口阀有问题 - 更换阀组件柱塞杆有问题 - 更换柱塞杆及其密封圈溶剂混合不良 - 加装混合器电噪声 - 去除噪声源非周期性噪声气泡 - 流动相脱气检测池内有气泡 - 流动相脱气, 检测池后加适当反压系统有漏液之处 - 检漏并处理溶剂混合不良 - 加装混合器电噪声 - 去除噪声源基线噪声系统未充分平衡梯度系统 - 溶剂A于溶剂B的ABS值相差大 - 试用另种溶剂或使用基线扣除法色谱柱有其他组份被洗脱出 - 冲洗, 直至基线稳定溶剂发生变化 (如溶入气体或溶剂挥发) - 氦气或脱气机脱气, 溶剂瓶避光,密封(但要 注意防止溶剂瓶内产生负压)系统有漏液之处 - 检漏并处理环境

3、温度影响 (尤其对示差,电导,电化学检测) - 室温,柱温,检测池温度控制反压变化 - 溶剂和样品过滤. 注意黏度过大的样品 基线漂移温度影响 - 环境温度及检测池温度控制. 注意空调机的影响溶剂混合不良 - 加装混合器流动相脱气不良 - 流动相脱气供电电源的影响 泵不良 - 检修处理 基线周期性波动气泡 - 溶剂脱气电路接触不良 - 保证清洁, 接线牢固, 接点无氧化光源灯不良- 检查处理电噪声 - 去除噪声源基线有无规律的尖峰脱气方法在线脱气机脱气 氦气脱气真空过滤脱气注意: 溶剂应每天脱气脱气方法未进样 泵未工作漏液流动相或样品的问题柱子或保护柱的问题数据采集装置的问题或其与检测器连线的

4、问题最简单快捷的检查 - 泵是否工作, 系统是否漏液, 进一针b苯或甲苯溶液检查检测器读数及数据单元是否有响应 无样品峰组份的ABS值小于溶剂的ABS值气泡通过了检测池对RI检测器不一定是有了问题，很可能是正常的所有峰都是负峰 - 可能是检测器输出与数据单元连线 极性接反负峰两个要点- 峰保留时间(RT)重现性, 峰面积重现性RT重现性不好 - 无规律变化 : *流量不稳 - 气泡, 漏液, 泵 *温度影响 有规律的变化, 且逐渐趋于稳定 : 系统未充分平衡 RT 重现性好, 但峰面积重现性不好 *进样量-选用定量管进样时,进样体积应大于3倍定量管容积; *样品, 气泡; *样品在流动相各组份

5、中不能充分溶解(通常伴随有柱压逐渐升高 且经反冲后,柱压会恢复正常之现象); *基线噪声的影响; *积分处理的影响;系统性能HPLC 系统组件 * 泵* 进样器/自动进样器* 色谱柱* 检测器* 数据系统所有组件均会发生问题，都需要进行故障排除！ HPLC色谱柱故障症状A. 色谱柱柱压B. 色谱峰峰形色谱柱柱压柱压过高 查原因，矫正柱压陶瓷片堵塞色谱柱污染色谱柱填料堵塞1 . 清洗色谱柱-清除色谱柱污染物和堵塞的柱填料-大分子量/色谱柱吸附物-样品或缓冲液沉淀2.反冲色谱柱-清洗堵塞的陶瓷片3.更换陶瓷片* 柱压问题有时由系统或预柱堵塞引起检查有 / 无色谱柱时系统的压力色谱柱柱压冲洗色谱柱-

6、用比流动相更强的溶剂反相色谱柱用以下溶剂至少各25mL冲洗色谱柱(分析柱) * 不含缓冲盐的流动相* 100%甲醇* 100%乙腈* 75%乙腈+25%异丙醇* 100%异丙醇 * 100%二氯甲烷 * 100%己烷*若使用己烷或二氯甲烷冲洗色谱柱，则在重新使用反相流动相以前，必须用异丙醇冲洗色谱柱 !正相色谱柱用以下溶剂至少各50mL冲洗色谱柱(分析柱)* 50%甲醇+50%三氯甲烷* 100%乙酸乙酯色谱柱柱压色谱柱柱压 预防柱压过高采取色谱柱保护措施样品制备适当适时冲洗色谱柱含缓冲盐的流动相一定要过滤保持更换缓冲液和水色谱峰峰形 * 裂分峰* 色谱峰拖尾* 色谱峰峰扩展* 柱效低色谱柱“

7、二次作用色谱柱死体积色谱柱污染色谱柱寿命色谱柱容量柱外效应 许多色谱峰峰形问题都是复合型问题色谱峰峰形 裂分峰* 色谱柱污染复杂样品基体或待测样品量大* 颗粒物堵塞陶瓷片复杂样品基体或待测样品量大* 色谱柱死体积流动相pH7时，硅胶溶解(除非使用特殊色谱柱)* 样品溶剂效应样品溶剂强于流动相-裂分峰和扩展峰取决于样品量色谱峰峰形色谱峰峰形色谱峰峰形裂分峰的原因1. 样品基体或待测物复杂色谱柱污染物或颗粒物堵塞陶瓷片滤芯2. 流动相 pH 7由于硅胶溶解导致色谱柱死体积增加（可使用能承受高pH的特殊固定相色谱柱避免此问题）3. 样品溶剂溶解能力强于流动相裂分峰和色谱峰扩宽（与进样体积有关）色谱峰

8、峰形 拖尾峰* 考虑流动相效应改变流动相pH或添加化学试剂消除二次作用* 考虑色谱柱选择选用高纯硅胶色谱柱或不同键合技术色谱柱* 减少样品进样量* 消除色谱柱柱外效应冲洗色谱柱，检查色谱柱寿命和死体积色谱峰峰形色谱峰峰形色谱峰峰形色谱峰峰形色谱峰峰形色谱峰峰形色谱峰峰形峰拖尾-柱外体积0.12mm内径管线用于毛细管HPLC中2.1内径色谱柱0.17mm内径管线用于分析型HPLC中2.14.6内径色谱柱0.25mm内径管线用于半制备型HPLC中9.4内径色谱柱0. 5mm内径管线用于制备型HPLC中21.2内径色谱柱50 mL 柱外体积（管线）4321Time (min)0.0 0.5 1.0 1.5 2.010 mL 柱外体积Time (min)0.0 0.5 1.0 1.5 2.04321样品: 1. 苯丙胺酸2. 5-苯基-3, 6-二氧-2-哌嗪乙酸3. Asp-Phe 4. 天冬甜素色谱柱: StableBond SB-C18, 4.6 x 30 mm, 3.5 mm 流动相: 85% H2O with 0.1% 三氟乙酸 : 15% ACN 流速: 1.0 mL/min 温度: 35C色谱峰峰形保留时间保留，色谱柱和分析结束时间都发生改变* 色谱柱寿命* 色谱柱污染* 平衡时