ILKsiRNADNA表达载体的构建

1、ILKsiRNADNA表达载体的构建李敏侠，刘必成，张露，张晓良摘要目的：构建针对整合素毗连激酶ILKRNA的小滋扰RNAsiRNA表达载体，为按捺ILK在哺乳动物细胞内表达、研究其成效奠基基矗要领：合成含靶向ILK基因siRNA转录模板的茎环布局，与两头别离有BaH、Hind酶切位点的Psilener3.1质粒毗连，大肠杆菌中扩增，测序断定。结果：转化大肠杆菌涂布平板长出阳性菌落,重组质粒电泳开端说明质粒构建乐成,测序结果表白Psilener3.1酶切位点BaH、Hind之间有64bp的插入片断，其序列与所方案、合成的ILKsiRNA转录模板序列同等。结论：siRNA转录模板完备准确地插入P

2、silener3.1质粒中。关键词小滋扰RNA；质粒；整合素毗连激酶；构建自1998年Fire等1用小滋扰RNAsallinterferingRNA,siRNA技能阻断特定基因的表达以来，RNA滋扰RNAinterferene，RNAi已生长成为一种经济、快捷、高效按捺基因表达的有力东西。siRNA是一种19个碱基互补配对、两头别离有两个碱基突出的2123nt的双链RNA,可以与细胞内核酶形成RNA诱导的沉默沉静复合体RNAinduedsileneplex,RIS。在此中一条RNA链的引导下，RIS特异性落解与siRNA同源的RNA2。siRNA制备要拥有多种，各有其优缺点，但假设在哺乳动物细

3、胞内一连不变表达siRNA,恒久按捺靶基因，以小的茎环布局RNA(shrthairpinRNA,shRNA)表达载体的要领和不变挑选的技能最为有用34。整合素毗连激酶integrinlinkedkinase,ILK是Hannigan等5于1996年起首创造的一种能与整合素结合的具有452个氨基酸残基的Ser/Thr卵白激酶。有研究表白,ILK在肾小管上皮细胞间充质转分化epithelialesenhyaltransitin,ET中发挥了紧张作用6。本研究拟构建一个ILKsiRNA表达载体，用此载体转染肾小管上皮细胞株，为应用RNAi技能按捺ILK表达,进一步研究ILK在肾小管ET中的作用提供物

4、质底子和技能支持。1质料与要领12要领121茎环布局的方案所方案茎环布局序列长度为64bp的反向重复序列,两头带有BaH、Hind酶切位点，中心被9bp环布局支解。并以6个T作为RNA聚合酶的转录停顿子，形成BaHSenseLpAntisense+停顿信号Hind的布局。序列如下：公理链，5GATGTGAGAAGTAAGAGAATTAAGAGATTTGTTGAGTTGTATTTTTTGGAAA3；反义链，3GATGTTGAGTTGTTTAAGTTTTAAGAGAATGAAGAGTAAAAAATTTTGA5。122单链ILKsiRNA转录模板退火酿成双链将合成的单链公理siRNA转录模板和单链反

5、义siRNA转录模板用无菌双蒸水稀释成1gl-1,别离取2l，加46l退火缓冲液，配成50l缓冲体系，置903in，迟钝落温至37，37恒温1h。123ILKsiRNAPsilener表达质粒构建取5l退火反响液，加45l无核酶去离子水，将退火后siRNA转录模板稀释成8ngl-1,取1l与线性空载Psilener3.1质粒1l、T4DNA毗连酶1l、毗连缓冲液1l、无核酶去离子水6l构成10l反响体系，置8留宿。以不含Psilener3.1的10l毗连反响体系作为比较。毗连产物转化感觉态大肠杆菌J,在含80gl-1氨卞青霉素平板上37生长留宿。非转化大肠杆菌涂布平板作为阴性比较。挑取阳性克隆

6、制备ILKsiRNAPsilener重组质粒。124重组质粒断定Abin公司环状Psilener3.1质粒(negtiventrlPsilener3.1)作为arker与重组质粒同时作0.8%琼脂糖凝胶电泳，大概断定。假设线性Psilener3.1质粒中乐成插入64bpsiRNA转录模板，那么与NegativentrlPsilener3.1质粒只存在酶切位点之间DNA序列的差异，碱基数量和别的布局均雷同，呈同样的超螺旋布局，以是在凝胶中的电泳速率雷同，以此开端断定挑取的6个克隆是否乐成插入了64bpsiRNA转录模板。再用ABI全主动测序仪举行序列断定。2结果2.1质粒电泳结果转化大肠杆菌涂布

7、平板长出阳性菌落，不含Psilener3.1毗连反响液转化J以及非转化J涂布平板均无菌落长出。挑取166个菌落提取质粒，电泳阐发。重组质粒电泳结果开端表白，1、2、3、5和6克隆ILKsiRNAPsilener质粒重组乐成图1。16.挑取6个阳性菌落提取质粒；.arker超螺旋质粒4552bp:环状质粒在凝胶中呈超螺旋布局，分子半径较小；线性子粒4552bp：质粒提取历程停顿裂而出现线性，分子半径较大图1重组质粒电泳断定Fig1Identifiatinftherebinantplasidthrugheletrphresis2.2重组质粒测序结果任选此中1个克隆测序结果证明：Psilener3.

8、1酶切位点BaH、Hind之间有一64bp的插入片断，其序列与所方案、合成的ILKsiRNA转录模板序列同等图2，因此以为已乐成构建了ILKsiRNA表达载体。3讨论用传统的基因敲除技能研究基因成效费时费力而且耗资昂贵。RNAi作为一项新的基因阻断技能，既高效特异，又轻便易行，在人类成效基因组研究、细胞信号转导研究及基因治疗等方面表现出宏大的应用远景。对付体外造就的哺乳动物细胞，RNAi能特异性阻断某种基因，到达基因敲除的结果，而用于被阻断基因成效的研究。特殊对付一些在胚胎发育中具有紧张作用的基因，可以在体外造就的细胞中使用RNAi技能研究它的成效8。别的，RNAi还可以按捺疾病中表达非常增高

9、的基因此大概成为基因治疗的东西。当前，已有研究者将RNAi技能用于白血病9、SARS10、HIV11、病毒性肝炎12的治疗研究中，并获得了必然希望。1994年，Strutz等13起首创造，疾病状态下，肾小管上皮细胞可以或许表告竣纤维细胞标识表记标帜,从而提出了ET的观点，即肾小管上皮细胞失去其原有上皮细胞表型而得到间充质细胞表型的历程。之后很多研究证明，转分化了的肾小管上皮细胞是肾小管间质纤维化tubulinterstitialfibrsis,TIF时肌成纤维细胞的重要泉源，后者是胞外基质沉积的重要效应细胞。ILK普及表达于哺乳动物种种细胞内，到场了整合素介导的细胞粘附、形态改变、基因表达以及

10、胞外基质extraellularatrix,E沉积等浩繁生物历程。作者地点实行室既往研究表白,人结缔构造生长因子(nnetivetissuegrthfatr,TGF)能特异性诱导体外造就的人近端肾小管上皮细胞产生ET,并呈时间浓度依靠性地引起ILKRNA和卵白质表达的增长14。在单侧输尿管阻断小鼠模子上的研究也创造早期TGF与ILK表达增高,并大概到场了肾小管上皮细胞ET15。本研究中所接纳的Psilener3.1质粒的启动子H1是RNA聚合酶pl启动子，易在嘌呤起始处开始转录，因此我们在目的序列前siRNA翻译起始处增长1个鸟嘌呤G，以进步转录服从。ILKsiRNA转录模板被克隆到H1卑劣。

11、当这种带有pl和ILKsiRNA转录模板的Psilener3.1质粒转染哺乳动物细胞后，pl在离启动子的结实位置开始合成RNA，直至碰到3或4个一连的U停顿转录。合成的shRNA在细胞内一种RNA酶Dier酶的作用下环布局被切掉，成为双链的siRNA。为防范转染服从较低而影响后期实行研究，Psilener3.1质粒具有潮霉素这一真核细胞挑选标识表记标帜,假设转染了带有潮霉素抗性的质粒，就可以在潮霉素的选择压力下富集带有质粒的细胞，淘汰配景影响。本研究使用DNA克隆技能乐成构建了ILKsiRNA表达载体，为研究ILK在ET中的作用奠基了基矗参考文献1FIREA,XUS,ELB,etal.Pten

12、tandspeifigenetiinterferenebydsRNAinaenrhabditiselegansJ.Nature,1998,391(6669)：806811.2ELBASHIRS,LENDEKEL,TUSHLT.RNAinterfereneisediatedby21and22nuletideRNAsJ.GenesDev,2001,15(2):188200.3DYKXHRND,NVINAD,SHARPPA.Killingtheessenger：shrtRNAsthatsilenegeneexpressingJ.NatRevlellBil，2022,4(6)：457467.4BRUE

13、LKAPTR,BERNARDSR,AGAIR.AsystefrstableexpressinfshrtinterferingRNAsinaalianellsJ.Siene,2002,296(5567):550553.5HANNIGANGE,LEUNGHAGESTEiJN,FITZGIBBNIBBNL,etal.Regulatinfelladhesinandanhragedependentgrthbyanebeta1integrinlinkedprteinkinaseJ.Nature，1996,379(6560):9196.6LIY,YANGJ,DAI,etal.Rlefrintegrinlin

14、kedkinaseinediatingtubularepithelialtesenhyaltransitinandrenalinterstitialfibrgenesisJ.JlinInvest,2022,112(4)：503516.7TRUSSARDAA,AJIN,NG,etal.nditinalknkutfintegrinlinkedkinasedenstratesanessentialrleinprteinkinaseB/AktavtivatinJ.JBilhe,2022,278(25):2237422378.8NVINAD,SHARPPA.TheRNAirevlutinJ.Nature

15、,2022,430(6996)：161164.9ILDA,FUHSU,SSANN,etal.KillingfleukeiellsithaBR/ABLfusingenebyRNAintefereneJ.ngene,2002,21(37):57165724.10LUA,ZHANGH,ZHANGX,etal.AttenuatinfSARSrnavirusbyashrthairpinRNAexpressinplasidtargetingRNAdependentRNAplyeraseJ.Virlgy,2022,324(1):8489.11HIUYL,AH,JAQUEJ,etal.Inhibitinfhu

16、aniundefiienyvirustype1repliatinbyRNAinterferenediretedagainsthuantransriptinelngatinfatrPTEFb(DK9/ylinT1)J.JVirl,2022,78(5)：25172529.12HENGTL,HANG,SUIJ,etal.TherapeutiinhibitinfhepatitisBvirussurfaeantigenexpressinbyRNAinterfereneJ.BiheBiphysResun,2022,336(3):820830.13STRUTZF,KADAH,L,etal.Identifiatinan