Na+K+ATP酶β1亚基与肿瘤细胞生长相关性

1、Na+，K+-ATP酶1亚基与肿瘤细胞生长相干性熊竹娟林苹张洁王修杰王琪任婧婧杨嘹亮王静吴亚英【摘要】目的探究Na+，K+-ATP酶1亚基ATP1B1与肿瘤细胞增殖分化的干系，以及外源性ATP1B1对肿瘤细胞的影响。要领接纳RT-PR检测肿瘤细胞株、正常外周血单核细胞中ATP1B1的RNA程度，以及经脂多糖LPS促进细胞增殖、二甲亚砜DS诱导肿瘤细胞分化后ATP1B1的RNA程度变革，并不雅察通过转染技能增长肿瘤细胞中ATP1B1表达后细胞的生长环境。效果肿瘤细胞株中ATP1B1的RNA程度显着高于正常单核细胞P0.05，促进细胞增殖后细胞中ATP1B1的RNA程度增高P0.05，诱导分化后低

2、落P0.05，导入外源性ATP1B1使肿瘤细胞增殖显着受抑P0.05。结论Na+，K+-ATP酶1亚基可以成为反响细胞成效状态特殊是肿瘤细胞增殖代谢的紧张指标，为肿瘤生物治疗的新计谋提供紧张的实行根据。【关键词】Na+K+-ATP酶1亚基肿瘤细胞增殖诱导分化Abstrat:PurpseTexplretherelatinshipbeteenNa+,K+-ATPase1-Subunit(ATP1B1)andturellinprliferatinanddifferentiatin,asellastheeffetfATP1B1intrdutin.ethdsThelevelsfATP1B1RNAered

3、etetedbyRT-PRinbthfturelllinesandnralperipheralbldnyte,andthehangingfATP1B1RNAereanalyzedintheprliferatin-ellsstiulatedbyLPSandthedifferentiatin-ellsinduedbyDS.rever,survivalfellstransfetedithATP1B1asbserved.ResultsTheexpressinfATP1B1RNAinturellassignifiantlyhigherthanthatfnralnyteP0.05.ATP1B1RNAlev

4、elasenhanedinturelllinesandnytesbyLPSstiulatinP0.05,hilethelevelfATP1B1RNAftheseellseredereasedbyDS-indueddifferentiatinP0.05.ThegrthftheturellstransfetedithATP1B1asinhibitedbviusly(P0.05.nlusinATP1B1anbetheindexfellfuntinalstatus,espeiallyturellprliferatinanddifferentiatin.Itillbeeaniprtantexperien

5、tfundatinfrthebitherapyftur.Keyrds:Na+,K+-ATPase1-subunit;turell;prliferatin;differentiatinNa+，K+-ATP酶是一种普及存在于真核生物细胞上的跨膜转运卵白，重要调治细胞表里Na+、K+的平衡，维持细胞的容积和包管细胞内环境的不变。Na+，K+-ATP酶大概与肿瘤的转移有关，已有将其作为治疗乳腺癌靶点的研究1。有关Na+，K+-ATP酶与细胞成效干系的研究渐渐成为存眷热门，如今亚基的研究较多，而对Na+，K+-ATP酶的调控亚基亚基的研究较少。我们检测了多种细胞的Na+，K+-ATP酶基因表达环境，创造

6、正常外周血单核细胞与肿瘤细胞株间的ATP1B1RNA表达有着明显的差异性，而细胞增殖和细胞分化后ATP1B1基因表达又有变革，向细胞中导入ATP1B1有着显着的按捺细胞增殖效应。1质料与要领1.1质料与试剂RNA抽提试剂盒购自上海华舜生物技能，RT-PR一步法试剂盒及PR引物自TaKaRa公司购置和合成。ATP1B1真核表达载体ATP1B1-V-flag及载体pFLAGV-1由日本国立长命研究中央中岛副传授惠赠,人胃腺癌SG7901细胞、肝癌S7721细胞、肺腺癌SP-A-1细胞、脑胶质瘤U251细胞、乳腺癌F-7细胞、单核细胞白血病THP-1细胞、急性早幼粒白血病NB4细胞、白血病Jurka

7、t细胞、慢性髓系白血病K562细胞由本室通例造就、保存，TT购自Siga公司,脂质体Lipfetaine2000购自Invitrgene公司。1.2肿瘤细胞株与正凡人外周血单核细胞中ATP1B1基因的表达网络细胞株SG7901、S7721、F-7、U251、SP-A-1、THP-1、NB4、Jurkat、K562以及正凡人外周血单核细胞，按RNA抽提试剂盒说明提取细胞总RNA，接纳一步法举行逆转录聚合酶链反响RT-PR测定ATP1B1RNA的表达。方案的引物为：上游引物：5-GAGGATTAAAAGATTTAG-3，卑劣引物：5-TTATTTATTGT-TG-3；内参照物-atin：上游引物：

8、5-AAATTTAAATGAG-3，卑劣引物：5-GTGAT-TTTTGATTGT-3。反响条件为：5015in，942in，9430s，6030s，721in25个循环。1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像体系不雅察。1.3细胞在增殖历程中ATP1B1基因的表达1.4诱导分化肿瘤细胞株的ATP1B1基因的表达1.5ATP1B1-V-flag转染S7721细胞取对数生恒久S7721细胞3103接种于96孔板，50%融适时举行转染。别离取ATP1B1-V-flag以及空载体pFLAGV-1DNA50ng/孔、100ng/孔、150ng/孔、200ng/孔、250ng/孔、300ng/孔，脂质体Lip

9、fetaine20000.3g/孔按通例要领举行转染。并以转染脂质体0.3g/孔作为比较，未转染的细胞作为空缺比较，每组设3个复孔。1.6转染后细胞体外造就生物学举动不雅察在光学倒置显微镜下不雅察其形态变革。经转染的细胞37、5%2、饱和湿度造就72h后，通例TT法测定各孔吸光度值A值，细胞按捺率%=1-实行组A值/空缺比较组A值100%。1.7统计学处置惩罚数据接纳SPSS10frinds软件阐发处置惩罚，转染效果举行单因素方差阐发，细胞增殖分化实行组与比较组接纳t查验。2效果2.1肿瘤细胞株中ATP1B1基因RNA表达别离测定实体肿瘤细胞株SG7901、S7721、U251、F-7、SP-

10、A-1，血液肿瘤细胞株K562、NB4、Jurkat、THP-1和正凡人单核细胞的ATP1B1基因RNA，在肿瘤细胞株可见到422bp的扩增条带，与方案的扩增片断巨细符合，细胞株间ATP1B1基因表达强度有必然的差异，而正凡人单核细胞均未见阳性条带。2.2在增殖历程中ATP1B1基因RNA表达增高接纳LPS刺激肿瘤细胞株K562、Jurkat及正常单核细胞增殖，RT-PR效果表现：经刺激增殖的细胞中ATP1B1基因RNA表达均较无刺激的加强，此中K562细胞最显着242.15%2.39%，单核细胞180.42%3.47%和Jurkat细胞133.64%3.01%刺激增殖后ATP1B1基因RNA

11、略有增高，各LPS刺激组和无LPS组间的差异均有统计学意义(P0.05)。2.3诱导分化后细胞ATP11基因RNA表达低落肿瘤细胞株S7721、Jurkat、SP-A-1经DS诱导分化后检测ATP11基因表达量，效果表现S7721、SP-A-1细胞ATP1B1RNA表达量较未经诱导分化的淘汰，按捺率别离为28.99%0.25%、65.81%0.58%(P0.05)，Jurkat细胞淘汰不显着1.53%0.95%(P0.05)。2.4转染后细胞体外造就生物学举动不雅察S7721转染表达质粒ATP1B1-V-flag组细胞变革明显。细胞增殖显着受抑，50ng/孔开始细胞即有大量皱缩变小变圆，别的细

12、胞胞浆中出现微小空泡，细胞呈中央膨大附近细长的梭型或多边行。转染pFLAGV-1或脂质体的细胞增殖较空缺组稍少，胞浆中有少量空泡。空缺组细胞增殖好，形态正常，细胞舒展彼此毗连。转染ATP1B1-V-flag组对S7721细胞的生长有显着的按捺作用，从50ng/孔350ng/孔按捺率别离为42.39%0.67%、43.68%1.13%、45.69%0.33%、50.04%0.94%、49.56%0.71%、47.51%0.47%、50.43%1.69%，对应的pFLAGV-1组对细胞生长的按捺率别离为2.43%0.56%、8.23%0.88%、8.36%0.95%、10.20%1.01%、11.

13、66%0.82%、12.32%0.87%、17.08%1.72%。各转染雷同DNA浓度的ATP1B1-V-flag组与pFLAGV-1组对细胞生长的按捺效应有明显差异性P0.05，见图1。3讨论Na+，K+-ATP酶重要由亚基和亚基组成，亚基是催化亚基，调治亚基是Na+，K+-ATP酶极化漫衍的关键因子2。在哺乳动物中亚基有3个亚型：1、2、3，1最普及3，位于细胞膜上24，各亚型的成效还不非常明晰。亚基大概在全酶布局和成效的成熟、调治酶对阳离子的亲和性以及将亚基传送到胞膜中发挥作用2，57。Beguin等8指出亚基可以防范亚基在内质网中的落解。本实行通过RT-PR检测到肿瘤细胞株ATP1B1

14、基因表达量普及高，而正常成人单核细胞中表达低。这大概与肿瘤细胞生物学特性有关，即增殖本领强，代谢茂盛，那么Na+，K+-ATP酶含量增多或成效加强，随之ATP1B1基因表达量也有所增高。为证明这一推论，我们进一步检测ATP1B1基因表达量的变革。实行效果表白在LPS刺激细胞处于增殖茂盛状态下，ATP1B1基因表达量增高；而使用DS减慢细胞增殖速率、加强分化后ATP1B1基因表达量低落。从而证明了ATP1B1基因表达量与细胞增殖、代谢的干系，即细胞增殖快时ATP1B1基因表达量增高，反之低落。而对DS作用不敏感的Jurkat细胞，在DS诱导后其ATP1B1RNA改变的程度较小，也说明白ATP1B

15、1基因表达量的变革可以反响细胞增殖状态和活性。我们转染ATP1B1表达质粒于肿瘤细胞，实行表白增长ATP1B1在肿瘤细胞中的表达可以或许明显按捺肿瘤细胞的生长，乃至使其变性殒命。导入空载体不会显着出现该征象，这大概与增长ATP1B1表达能加强ATP酶活性有关。Lira等将ATP1B1转染到H细胞中可以上调内源性亚基的表达，使亚基到达细胞外貌5；Rajasekaran等也指出哺乳动物细胞中1亚基可以促进1亚基RNA的翻译，增长内质网中亚基的合成，导致11复合物的增长，以及Na+，K+-ATP酶活性的加强。说明在细胞中增长外源性ATP1B1的表达会影响Na+，K+-ATP酶活性，陪同Na+，K+等

16、离子互换加强，促使细胞表里离子浓度的失衡，导致细胞内环境的杂乱，引起细胞一系列的变革。但由于增长ATP1B1-脂质体复合体的转染量势必加大脂质体的浓度脂质体自己也是细胞生长的影响因素，我们的实行中0.3g/孔的脂质体对细胞增殖影响小而又能和足量的ATP1B1结合发挥作用，如许就存在复合体结合的饱和题目，以是我们在实行中不雅察到当ATP1B1的量增长到必然程度对细胞生长的改变将趋于不变。本文从必然程度上证明白该亚基能反响细胞成效状态，特殊是肿瘤细胞的增殖代谢环境，从而为临床上断定肿瘤的恶性程度以及肿瘤的早期诊断提供必然的实行根据。【参考文献】1henJQ,ntrerasRG,angR,etal.

17、Sdiu/ptasiuATPase(Na(+),K(+)-ATPase)anduabain/relatedardiaglysides:aneparadigfrdevelpentfanti-breastanerdrugs?J.BreastanerResTreat,2022,96(1):1-15.2ShshaniL,ntrerasRG,RldanL,etal.TheplarizedexpressinfNa+,K+-ATPaseinepitheliadependsntheassiatinbeteenbeta-subunitslatedinnEighbringellsJ.lBilell,2022,16(3):1071-1081.3ShaY,Isail-BeigiF.ntrlfNa+-K+-ATPasebeta1-subunitexpressin:rlef3-untranslatedreginJ.AJPhysilellPhysil,2022,286(3):580-585.4RajasekaranSA,GpalJ,illisD,etal.Na,K-ATPasebeta1-subunitinreasesthetranslatineffiienyfthealpha1