医院细胞遗传室人淋巴细胞培养及染色体制备作业指导书

1、医院细胞遗传室人淋巴细胞培养及染色体制备作业指导书目的规范外周血标本细胞培养及染色体制备过程，为临床外周血淋巴细胞染色体核型分析可靠性提供质量保证。测试方法密闭式培养/手工收获测试原理外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G期或G期，一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入植物血凝素( phytohemagglutinin PHA )时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂。经过短期培养后，用秋水仙素处理就可获得大量中期分裂相的细胞，制 片后可以清楚地对染色体进行观察与分析。性能特征经G显带处理后可见 300-550条显带。. 样本特征及受检者准备外周血用5ml 灭菌注射器吸取注

2、射用肝素(6250U/ml )0.05 ml湿润管壁。消毒皮肤，于肘静脉采血约 5ml,立即 送检 。试剂人体外周血淋巴细胞培养基(必须具备三证)，秋水仙素：浓度20以g/ml低渗液：0.075mol/L的KCl溶液，卡诺固定液试剂与耗材超净工作台、待检标本、酒精灯，烧杯，天平，离心机，恒温培养箱，冰盒，载玻片，玻片盒，光学显微镜，灭菌注射器（5ml） ，离心管，无菌吸管，量筒，培养瓶，试剂瓶等。操作程序淋巴细胞培养与处理取血：外周血用5ml 灭菌注射器吸取注射用肝素（ 6250U/ml ） 0.05 ml 湿润管壁。消毒皮肤，于肘静脉采血约5ml。在酒精灯火焰旁，向培养瓶内人体外周血淋巴细胞

3、培养基中接种，外周血每瓶0.3-0.5ml （用 5ml 的注射器的7 号黑色针头垂直滴加；男：G 带：1 线 28 滴， 2 线 30 滴；女性多种2 滴） 。接种后轻轻水平摇动几次混匀。 TOC o 1-5 h z 细胞培养：直立于培养箱内密闭式培养箱培养66-72小时。外周血淋巴细胞培养环境的温度为37cC 0.5 0C,且一定要以温箱内部温度为准，每隔24 小时左右轻摇1 次，以促进细胞生长增殖；秋水仙素处理：培养终止前在培养基中加入浓度为20以g/ml的秋水仙素0.01-0.02ml （用1ml注射器针头垂直滴 加23滴），使最终浓度为 0.04-0.08以g/ml , 370C 0

4、.5 oC培养箱中处理4 小时；低渗处理：秋水仙素处理完毕后，小心地从温箱取出培养瓶，用吸管吸取培养物入离心管，离心(1500rpm,10min )。然后加入 37oC温育的 0.075mol/L 的 KCl低渗溶液8ml,用吸管吹打成细胞悬液，置37oC水溶处理35min；预固定：在每个离心管中加入1.5ml 的固定液，继续37oC水浴，5-10min ;离心： 1500rpm 10min ，弃上清液；固定：在离心管中加入固定液6-8ml ，立即用吸管轻轻吹打，单个细胞悬液，在 37oC水溶中固定5-10min 后，离心，1500rpm, 10min,弃上清液；再固定：重复第 6 步；制片：

5、在离心管中滴入新固定液0.2 毫升，用吸管将淋巴细胞团轻轻吹打成细胞悬液，从冰箱的冷冻室内取出冰片，每片滴加悬液 1-2滴，75oC烤3小时；染色：用0.025%胰酶消化后用 Giemsa染液染色(消化时间和染色时间因环境变化有差别，因此每次显带染色应进行预实验)，然后用镊子夹出玻片，用自来水轻轻冲洗两面，室温干燥或电吹风吹干；镜检：待玻片干后，在显微镜下检查。先用低倍镜寻找良好的分裂相，然后用高倍油镜观察。9 参考范围染色体数目：46,XN ；染色体结构：无明显结构异常潜在变异来源1）不排除细胞培养过程中发生突变的可能性，从而导致染色体数目或结构改变，因此应严格执行1-2 线平行操作，以发现因培养过程导致的结果异常。2）接种所用器皿要进行严格的灭菌处理。3）秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。都不宜观察形态及计数。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。4）低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度及时间要适当。且低渗后混匀细胞一定要轻，否则引起膜破裂、染色体散失。5）固定液应在使用前临时配制，要求新鲜，否则将形成脂类，从而影响固定效果环境安全1）试剂中含有防腐剂和稳定剂, 请勿直接接触皮肤、眼睛、黏膜，一旦接触，立即用大量清