分子生物学1cDNA与cccDNAcDNA是由mRNA通过反转录酶合成

1、一、1cDNA 与 cccDNA：cDNA 是由 mRNA 通过反转录酶的双链DNA；cccDNA 是游离于之外的质粒双链闭合环形DNA。2标准折叠：蛋白质二级结构单元螺旋与折叠通过各种连接多肽可以组成特殊几何排列的结构块，此种确定的折叠类型通常称为超二级结构。几乎所有的三级结构都可以用这些折叠类型，乃至他们的组合型来予以描述，因此又将其称为标准折叠。3CAP：环腺苷酸（c）受体蛋白 CRP（creceptor protein ），c与 CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白 CAP（cactivated protein ）4回文序列：DN段上的一段所具有的反向互补序列，常是限制性酶切位点。5m

2、icRNA：互补干扰 RNA 或称反义RNA，与 mRNA 序列互补，可抑制 mRNA 的翻译。6核酶：具有催化活性的RNA，在 RNA 的剪接加工过起到自我催化的作用。7模体：蛋白质分子空间结构中存在着某些形状和拓扑结构颇为类似的局部区域8信号肽：在蛋白质过N 端有 1536 个氨基酸残基的肽段，引导蛋白质的跨膜。9弱化子：在区与结构之间的一段可以终止转录作用的核苷酸序列。10魔斑：当细菌生长过，遇到氨基酸全面缺乏时，细菌将会产生一个应急反应，停止全部的表达。产生这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸(ppGpp) 和鸟苷五磷酸（pppGpp）。PpGpp 与 pppGpp 的作用不只是一个或几个子

3、，而是影响一大批，所以称他们是超级调控子或称为魔斑。11上游启动件：是指对启动子的活性起到一种调节作用的 DNA 序列，-10 区的A、-35 区的 TGACA 及增强子，弱化子等。12DNA 探针：是带有标记的一段已知序列 DNA，用以检测未知序列、筛选目的等方面广泛应用。13SD 序列：是核糖体与 mRNA 结合序列，对翻译起到调控作用。14单克隆抗体：只针对单一抗原决定簇起作用的抗体。15考斯质粒：是经过人工构建的一种外源 DNA 载体，保留噬菌体两端的 COS 区，与质粒连接。16蓝-白斑筛选：含 LacZ（编码半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物 X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-

4、半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA后，LacZ不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝-白斑筛选。17顺式作用元件：在 DNA 中一段特殊的碱基序列，对的表达起到调控作用的元件。18Klenow 酶：DNA 聚合酶 I 大片段，只是从DNA 聚合酶 I 全酶中去除了 5 3外切酶活性19锚定 PCR：用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚 dG 的尾巴，然后分别用多聚 dC 和已知的序列作为引物进行 PCR 扩增。20融合蛋白：真白的与外源连接，同时表达翻译出的原蛋白与外源蛋白结合在一起所组成的蛋白质。二、填 空1 DNA 的物理图谱是 DNA 分

5、子的（限制性内切酶酶解 ）片段的排列顺序。2 RNA 酶的剪切分为（自体催化 ）、（异体催化 ）两种类型。3原核生物中有三种起始因子分别是（IF-1）、（ IF-2 ）和（IF-3 ）。4蛋白质的跨膜需要（ 信号肽 ）的引导，蛋白伴侣的作用是（辅助肽链折叠成天然构象的蛋白质）。5启动子中的元件通常可以分为两种：（启动件 ）和（上游启动件 ）。6分子生物学的研究内容主要包含（结构分子生物学 ）、（表达与调控 ）、（ DNA 重组技术 ）三部分。7证明DNA 是遗传物质的两个关键性实验是（球菌小鼠 ）、（ T2 噬菌体大肠杆菌 ）这两个实验中主要的论点是：（生物体吸收的外源 DNA 改变了其遗传潜

6、能 ）。8hnRNA 与 mRNA 之间的差别主要有两点：（ hnRNA 在转变为 mRNA 的过经过剪接，）、（ mRNA 的 5末端被加上一个 m7pGppp 帽子，在 mRNA3末端多了一个多聚腺苷酸(polyA)尾巴）。9蛋白质多亚基形式的优点是（亚基对 DNA 的利用来说是一种经济的方法 ）、（可以减少蛋白质过随机的错误对蛋白质活性的影响）、（活性能够非常有效和迅速地被打开和被关闭 ）。10蛋白质折叠机制首先成核理论的主要内容包括（成核 ）、（结构充实）、（最后重排）。11半乳糖对细菌有双重作用；一方面（可以作为碳源供细胞生长 ）；另一方面（它又是细胞壁的成分 ）。所以需要一个不依赖

7、于 cCRP 的启动子 S2 进行本底水平的型；同时需要一个依赖于 cCRP 的启动子 S1 对高水平进行调节。有 G 时转录从（ S2 ）开始，无G 时转录从（ S1 ）开始。12DNA 重组技术也称为（克隆）或（分子克隆 ）。最终目的是（把一个生物体中的遗传信息DNA 转入另一个生物体）。典型的 DNA 重组实验通常包含以下几个步骤：提取供体生物的目的（或称外源），酶接连接到另一 DNA 分子上（克隆载体），形成一个新的重组DNA 分子。将这个重组 DNA 分子转入受体细胞并在受体细胞中保存，这个过程称为转化。对那些吸收了重组DNA 的受体细胞进行筛选和鉴定。对含有重组 DNA 的细胞进行

8、大量培养，检测外援是否表达。13、质粒的类型有两种：受到宿主细白质的严格控制的称为（型质粒），不受宿主细白质的严格控制称为（ 松弛型质粒 ）。14PCR 的反应体系要具有以下条件：a、被分离的目的两条链各一端序列相互补的 DNA 引物（约 20 个碱基左右）。b、具有热稳定性的酶如：TagDNA 聚合酶。c、dNTPd、作为模板的目的DNA 序列15PCR 的基本反应过程包括：（变性）、（退火）、（延伸 ）三个阶段。16、转动物的基本过程通常包括：将克隆的外源导入到一个卵或胚胎干细胞的细胞核中；接种后的卵或胚胎干细胞移植到雌性的；完成胚胎发育，生长为后代并带有外源；利用这些能产生外源蛋白的动物

9、作为种畜，培育新的纯合系。17杂交瘤细胞系的产生是由（脾 B）细胞与（骨髓瘤 ）细胞杂交产生的，由于（脾细胞）可以利用次黄嘌呤，（ 骨细胞 ）提供细胞功能，所以能在 HAT 培养基中生长。18随着研究的深入第一代抗体称为（多克隆抗体）、第二代（单克隆抗体）、第三代（基因工程抗体 ）。19目前对昆虫的工程改造主要集中于杆状，表现在引入（外源毒蛋白）；（ 扰乱昆虫正常生活周期的）；（ 对进行修饰 ）。20哺乳类RNA 聚合酶启动子中常见的元件A、GC、CAAT 所对应的反式作用蛋白因子分别是（ TFIID ）、（ SP-1 ）和（ CTF/NF1 ）。21RNA 聚合酶的基本转录因子有、TF-A、

10、TF-B、TFII-D、TF-E 他们的结合顺序是： （ D、A、B、E ）。其中 TFII-D 的功能是（与A 盒结合 ）。22与 DNA 结合的转录因子大多以二聚体形式起作用，转录因子与 DNA 结合的功能域常见有以下几种（ 螺旋-转角-螺旋 ）、（ 锌指模体 ）、（碱性-亮氨酸拉链模体 ）。23限制性内切酶的切割方式有三种类型分别是（在对称轴 5 侧切割产生 5 粘端 ）、（在对称轴 3 侧切割产生 3 粘端（在对称轴处切割产生平段）。24质粒DNA 具有三种不同的构型分别是：（ SC 构型 ）、（ oc 构型 ）、（ L 构型 ）。在电泳中最前面的是（ SC 构型 ）。25外源表达系统

11、，主要有（大肠杆菌）、（ 酵母）、（ 昆虫 ）和（ 哺乳类细胞表 ）。26转动物常用的方法有：（逆转录法）、（DNA显微注射法）、（胚胎干细胞法 ）。三、简 答1 分别说出 5 种以上RNA 的功能？转运 RNA tRNA 转运氨基酸白体RNA rRNA白体组成成信使 RNA mRNA 蛋白质模板不均一核RNA hnRNA 成熟 mRNA 的前体小核 RNA snRNA 参与 hnRNA 的剪接小胞浆 RNA scRNA/7SL-RNA 蛋白质内质网定位的信号识别体的组成成分反义 RNA anRNA/micRNA 对的表达起调节作用核 酶 Ribozyme RNA 有酶活性的 RNA2原核生物

12、与真核生物启动子的主要差别？原核生物TTGACA -AAT起始位点-35 -10真核生物增强子-GC -CAAT-AA5mGpp起始位点-110 -70 -253对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？天然质粒往往存在着缺陷，因而不适合用作工程的载体，必须对之进行改造构建：a、加入合适的选择标记，如两个以上，易于用作选择,通常是抗生素。b、增加或减少合适的酶切位点，便于重组。c、缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量。d、改变子，变为松弛，变少拷贝为多拷贝。e、根据工程的特殊要求加装特殊的元件4举例说明差示筛选组织特异 cDNA 的方法？两种细胞群体，目的在其中一种细胞中表达或高

13、表达，在另一种细胞中不表达或低表达，然后通过杂交对比找到目的。例如：在肿瘤发生和发展过，肿瘤细胞会呈现与正常细胞表达水平不同的 mRNA，因此，可以通过差示杂交筛选出与肿瘤相关的。也可利用诱导的方法，筛选出诱导表达的。5杂交瘤细胞系的产生与筛选？脾 B 细胞+骨髓瘤细胞，加聚乙二醇（PEG）促进细胞融合，HAT 培养基中培养（内含次黄嘌呤、氨基蝶呤、T）生长出来的脾 B-骨髓瘤融合细胞继续扩大培养。细胞融合物中包含：脾-脾融合细胞：不能生长，脾细胞不能体外培养。骨-骨融合细胞：不能利用次黄嘌呤，但可通过第二途 径利用叶酸还原酶嘌呤。氨基蝶呤对叶酸还原酶有抑制作用，因此不能生长。骨-脾融合细胞：

14、在 HAT 中能生长，脾细胞可以利用次黄嘌呤，骨细胞提供细胞功能。6、利脱氧末端终止法（Sanger 法）测定 DNA 一级结构的原理与方法？原理是采用核苷酸链终止剂2，3，-双脱氧核苷酸终止 DNA 的延长。由于它缺少形成3/5/磷酸二脂键所需要的 3-OH，一旦参入到 DNA 链中，此 DNA 链就不能进一长。根据碱基配对原则，每当 DNA 聚合酶需要 dNMP 参入到正常延长的 DNA 链中时，就有两种可能性，一是参入 ddNTP,结果导致脱氧核苷酸链延长的终止；二是参入 dNTP,使 DNA链仍可继续延长，直至参入下一个 ddNTP。根据这一方法，就到一组以 ddNTP 结尾的长短不一

15、的 DN段。方法是分成四组分别为 dd、ddGMP、ddCMP、ddTMP 反应后，聚丙烯酰胺凝胶电泳按泳带可读出DNA 序列。7、激活蛋白（CAP）对转录的正调控作用？环腺苷酸（c）受体蛋白 CRP（creceptor protein），c与 CRP 结合后所形成的复合物称激活蛋白 CAP（cactivated protein ）。当大肠杆菌生长在缺乏葡萄糖的培养基中时，CAP量增加，CAP 具有激活乳糖（Lac）等启动子的功能。一些依赖于CRP 的启动子缺乏一般启动子所具有的典型的-35 区序列特征（TTGACA）。因此 RNA 聚合酶难以与其结合。CAP 的存在（功能）：能显著提高酶与启

16、动子结合常数。主要表现以下二方面：CAP 通过改变启动子的构象以及与酶的相互作用帮助酶分子正确定向,以便与-10 区结合，起到取代-35 区功能的作用。CAP 还能抑制 RNA 聚合酶与DNA 中其它位点的结合，从而提高与其特定启动子结合的概率。8、典型的DNA 重组实验通常包括哪些步骤？a、提取供体生物的目的（或称外源），酶接连接到另一 DNA 分子上（克隆载体），形成一个新的重组DNA 分子。b、将这个重组 DNA 分子转入受体细胞并在受体细胞中保存，这个过程称为转化。c、对那些吸收了重组DNA 的受体细胞进行筛选和鉴定。d、对含有重组 DNA 的细胞进行大量培养，检测外援是否表达。9、文

17、库的构建对重组子的筛出 3 种方法并简述过程。抗生素抗性筛选、抗性的失活、兰-白斑筛选 或PCR 筛选、差式筛选、DNA 探针多数克隆载体均带有抗生素抗性（抗氨苄青霉素、四环素）。当质粒转入大肠杆菌中后，该菌便获得抗性，没有转入的不具有抗性。但不能区分是否已重组。在含有两个抗性的载体中，如果外源 DN段其中一个并导致该失活，就可用两个分别含不同药物的平板对照筛选阳性重组子。 如 pUC 质粒含LacZ（编码半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物 X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源 DNA后，LacZ不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。10、说明通

18、过胚胎干细胞获得转动物的基本过程？胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES）：是胚胎发育期的胚细胞，可以人工培养增殖并具有分化成其它类型细胞的功能。ES 细胞的培养：分离胚泡的内层细胞团进行培养。ES 在无饲养层中培养时会分化为肌细胞、N 细胞等多种功能细胞，在含有成细胞中培养时 ES 将保持分化功能。可以对 ES 进行操作，不影响它的分化功能可以定点整合，解决了随机整合。向胚胎干细胞导入外源，然后植入到待孕雌鼠，发育成幼鼠，杂交获得纯合鼠。一、1、：能够表达和产生蛋白质和RNA 的 DNA 序列，是决定遗传性状的功能。 2、组：细胞或生物体的一套完整单倍体的遗传物质的总和。

19、3、端粒：以线性形式存在的真核组 DNA 末端都有一种特殊的结构叫端粒。该结构是一段 DNA 序列和蛋白质形成的一种复合体，仅在真核细胞末端存在。4、子：是指数个功能上相关的结构串联在一起，信息区，连同其上游的调控区（包括启动子和）以及下游的转录终止信号所的表达，所转录的RNA 为多顺反子。 5、 顺式作用元件：是指那些与结构表达调控相关、能够被调控蛋白特异性识别和结合的特异 DNA 序列。包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。 6、 反式作用因子：是指真核细胞内含有的大量可以通过直接或间接结合顺式作用元件而调节转录活性的蛋白质因子。 7、 启动子：是 RNA 聚合酶特

20、异性识别和结合的 DNA 序列。 8、 增强子：位于真核中远离转录起始点，能明显增强启动子转录效率的特殊 DNA 序列。它可位于被增强的转录的上游或下游，也可相距靶较远。 9、表达：是指生物组中结构所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，特定的蛋白质，进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。 10、 信息分子：调节细胞生命活动的化学物质。其中由细胞的调节靶细胞生命活动的化学物质称为细胞间信息分子；而在细胞内传递信息调控信号的化学物质称为细胞内信息分子。11、 受体：是存在于靶细胞膜上或细胞内能特异识别生物活性分子并与之结合，进而发生生物学效应的的特殊蛋白质。 12、 分子克隆：在体

21、外对 DNA 分子按照即定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入合适宿主，使其在宿主中扩增和繁殖，以获得该 DNA 分子的大量拷贝。 13、 蛋白激酶：是指能够将磷酸从磷酸供体分子转移到底物蛋白的氨基酸受体上的一大类酶。 14、 蛋白磷酸酶：是具有催化已经磷酸化的蛋白质分子发生去磷酸化反应的一类酶分子，与蛋白激酶相对应存在，共同了磷酸化和去磷酸化这一重要的蛋白质活性的开关系统。 15、工程：有目的的通过分子克隆技术，人为的操作改造，改变生物遗传性状的系列过程。 16、载体：能在连接酶的作用下和外源 DN段连接并运送 DNA 分子进入受体细胞的DNA 分子。 17、 转化：指质粒DNA 或以它为

22、载体构建的重组DNA 导入细菌的过程。 18、：以噬菌体、粘性质粒和真核细胞为载体的重组 DNA 分子，在体外经过包装成具有能力的或噬菌体颗粒，才能适当的细胞，并在细胞内扩增。 19、 转导：指以噬菌体为载体，在细菌之间转移 DNA 的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录转移和获得细胞 DNA 的过程。 20、 转染：指或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。 21、 DNA 变性：在物理或化学的作用下，导致两条 DNA 链之间的氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键则不受影响。 22、 DNA 复性：当促使变性的解除后，两条 DNA 链又可以通过碱基互补配对结合形成 DNA 双螺旋结构。

23、23、 退火：指将温度降至引物的 TM 值左右或以下，引物与 DNA 摸板互补区域结合形成杂交链。 24、 筑巢 PCR：先用一对外侧引物扩增含目的的大片段，再用内侧引物以大片段为摸板扩增获取目的。可以提高 PCR 的效率和特异性。 25、 原位 PCR：以组织固定处理细胞内的 DNA或 RNA 作为靶序列，进行 PCR 反应的过程。 26、 定量 PCR：表达涉及的转录水平的研究常需要对mRNA 进行定量测定，对此采用的 PCR 技术就叫定量PCR。27、打靶：是指通过 DNA 定点同源重组，改变组中的某一特定，从而在生物内研究此的功能。 28、 DNA：DNA技术是指在固相支持物上原位寡核

24、苷酸或者直接将大量的 DNA 探针以显微打印的方式有序地于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。由于常用计算机硅作为固相支持物，所以称为 DNA。 29、 错义突变：DNA 分子中碱基对的取代，使得 mRNA 的某一子发生变化，由它所编码的氨基酸就变成另一种的氨基酸，使得多肽链中的氨基酸顺序也相应的发生改变的突变。30、 无义突变：由于碱基对的取代，使原来可以翻译某种氨基酸的子变成了终止子的突变。 31、 同义突变：碱基对的取代并不都是引起错义突变和翻译终止，有时虽然有碱基被取代，但在蛋白质水平上没有引起变化，氨基酸没有被取代，这是因为突变后的子和

25、原来的子代表同一个氨基酸的突变。 32、 移码突变：在编码序列中，单个碱基、数个碱基的缺失或以及片段的缺失或等均可以使突变位点之后的三联体阅读框发生改变，不能编码原来的蛋白质的突变。 33、 癌：是细胞内控制细胞生长的，具有潜在的诱导细胞恶性转化的特性。当癌基因结构或表达发生异常时，其产物可使细胞增殖，导致肿瘤的发生。包括癌和细胞癌。 34、 细胞癌：存在于正常的细胞组中，与癌基因有同源序列，具有促进正常细胞生长、增殖、分化和发育等生理功能。在正常细胞内未激活的细胞癌叫原癌，当其受到某些条件激活时，结构和表达发生异常，能使细胞发生恶性转化。 35、癌：存在于（大多是逆转录）组中能使靶细胞发生恶

26、性转化的。它不编码结分，对无作用，但是当受到外界的条件激活时可产生诱导肿瘤发生的作用。 36、：以 DNA或 RNA 为材料，通过检查的存在、结构缺陷或表达异常，对的状态和疾病作出的方法和过程。 37、 RFLP：即限制性片段长度多态性，之间 DNA的核苷酸序列存在差异，称为 DNA 多态性。若因此而改变了限制性内切酶的酶切位点则可导致相应的限制性片段的长度和数量发生变化，称为 RFLP。 38、治疗：一般是指将限定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态为目的治疗方法。 39、 反义 RNA：碱基序列正好与有意义的 mRNA 互补的RNA 称为反义 RNA。可以作为一

27、种调控特定表达段。 40、核酶：是一种可以催化 RNA 切割和RNA 剪接反应的由RNA 组成的酶，可以作为表达和的抑制剂。 34、 细胞癌：存在于正常的细胞组中，与癌有同源序列，具有促进正常细胞生长、增殖、分化和发育等生理功能。在正常细胞内未激活的细胞癌叫原癌，当其受到某些条件激活时，结构和表达发生异常，能使细胞发生恶性转化。 35、癌：存在于（大多是逆转录）组中能使靶细胞发生恶性转化的。它不编码结分，对无作用，但是当受到外界的条件激活时可产生诱导肿瘤发生的作用。 36、：以 DNA 或RNA 为材料，通过检查的存在、结构缺陷或表达异常，对的状态和疾病作出的方法和过程。 37、 RFLP：即

28、限制性片段长度多态性，之间DNA 的核苷酸序列存在差异，称为 DNA 多态性。若因此而改变了限制性内切酶的酶切位点则可导致相应的限制性片段的长度和数量发生变化，称为 RFLP。 38、治疗：一般是指将限定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态为目的治疗方法。 39、 反义 RNA：碱基序列正好与有意义的 mRNA 互补的RNA 称为反义 RNA。可以作为一种调控特定表达段。 40、 核酶：是一种可以催化 RNA 切割和RNA 剪接反应的由RNA 组成的酶，可以作为表达和的抑制剂。 41、 三链 DNA：当某一 DNA 或 RNA 寡核苷酸与 DNA 高嘌呤区可结合形成

29、三链，能特异地结合在 DNA 的大沟中，并与富含嘌呤链上的碱基形成氢键。 42、 SSCP：单链构象多态性检测是一种基于 DNA 构象差别来检测点突变的方法。相同长度的单链 DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。 43、 管家：在生物体生命的全过程都是必须的，且在一个生物的几乎所有细胞中持续表达的。 44、 细胞全能性：指同一种生物的所有细胞都含有相同的DNA，即的数目和种类是一样的，但在不同阶段，同一的不同组织和中表达的种类和数目是不同的。 45、 SD 序列：转录出的 mRNA要进入核糖体上进行翻译，需要一段富含嘌呤的核苷酸序列与大肠杆菌 16S rRNA

30、3，末端富含嘧啶的序列互补，是核糖体的识别位点。 46、 反义核酸技术：是通过一种短链且与 DNA 或 RNA 互补的，以 DNA 或 RNA 为目标抑制翻译的反义分子，干扰目的的转录、剪接、转运、翻译等过程的技术。 47、 核酸探针：探针是指能与某种大分子发生特异性相互作用，并在相互作用之后可以检测出来的生物大分子。核酸探针是指能识别特异碱基顺序的带有标记的一段 DNA 或 RNA 分子。 48、 周期蛋白：是一类呈细胞周期特异性或时相性表达、累积与分解的蛋白质，它与周期素依赖性激酶共同影响细胞周期的运行。 49、 CAP：是大肠杆菌分解代谢物活化蛋白，这种蛋白可将葡萄糖饥饿信号传递个许多子

31、，使细菌在缺乏葡萄糖时可以利用其他碳源。 50、 顺反子 51、 结构域 二、 问答题（一）、原核、真核组的特点？答：1、组的特点： 种类单一；单倍体组：每个组在中只出现一次；形式多样；大小不一；动物/细菌病毒与真核/原核相似：内含子；具有不规则的结构；编码区无间隔：通过宿主及本身酶切；无帽状结构；结构没有翻译起始序列。2、原核组的特点： 为一条环状双链DNA；只有一个起点；具有子结构；绝大部分为单拷贝；可表达约 50%，大于真核生物小于；一般是连续的，无内含子；重复序列很少。 3、真核组的特点： 真核生物组远大于原核生物组，结构复杂，数庞大，具有多个起点；组DNA与蛋白质结，于细胞核内；真核

32、为反子，而细菌和的结构多为多顺反子；组中非编码区多于编码区；真核多为不连续的断裂，由外显子和内含子镶嵌而成；存在大量的重复序列；功能相关的各种；存在可移动的遗传；体细胞为双倍体，而和为单倍体。（二）、乳糖子的作用机制？答：1、乳糖子的组成：大肠杆菌乳糖子含 Z、Y、A 三个结构，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个序列 O，一个启动子 P 和一个调节I。 2、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I编码的阻遏蛋白结合于序列 O 处，乳糖子处于阻遏状态，不能分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于序列，乳糖子被诱导开放分解乳糖的三种酶。所以，

33、乳糖子的这种调控机制为可诱导的负调控。 3、CAP 的正性调节：在启动子上游有 CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，c浓度升高，与 CAP 结合，使 CAP 发生变构，CAP 结合于乳糖子启动序列附近的 CAP 结合位点，激活 RNA 聚合酶活性，促进结构转录，调节蛋白结合于子后促进结构的转录，对乳糖子实行正调控，加速分解乳糖的三种酶。 4、协调调节：乳糖子中的 I编码的阻遏蛋白的负调控与 CAP 的正调控两种机制，互相协调、互相制约。（三）、真核生物转录水平的调控机制？答：真核生物在转录水平的调控主要是通过反式作用因子、顺式作用元件和 RNA 聚合酶的

34、相互作用来完成的，主要是反式作用因子结合顺式作用元件后影响转录起始复合物的形成过程。 1、 转录起始复合物的形成：真核生物 RNA 聚合酶识别的是由通用转录因子与DNA 形成的蛋白质-DNA 复合物，只有当一个或多个转录因子结合到DNA 上，形成有功能的启动子，才能被 RNA 聚合酶所识别并结合。转录起始复合物的形成过：TFD 结合A 盒；RNA 聚合酶识别并结合TNA 复合物形成一个闭合的复合物；其他转录因子与 RNA 聚合酶结合形成一个开放复合物。在这个过，反式作用因子的作用是：促进或抑制 TFD 与A 盒结合；促进或抑制 RNA 聚合酶与 TNA 复合物的结合；促进或抑制转录起始复合物的

35、形成。 2、 反式作用因子：一般具有三个功能域（DNA 识别结合域、转录活性域和结合其他蛋白结合域）；能识别并结合上游调控区中的顺式作用元件；对的表达有正性或负性调控作用。3、 转录起始的调控： 反式作用因子的活性调节：表达式调节反式作用因子出来就具有活性；共价修饰磷酸化和去磷酸化，糖基化；配体结合许多激素受体是反式作用因子；蛋白质与蛋白质相互作用蛋白质与蛋白质复合物的解离与形成。反式作用因子与顺式作用元件的结合：反式作用因子被激活后，即可识别并结合上游启动件和增强子中的保守性序列，对转录起调节作用。反式作用因子的作用方式成环、滑动、Oozing。 反式作用因子的组合式调控作用：每一种反式作用

36、因子结合顺式作用元件后虽然可以发挥促进或抑制作用，但反式作用因子对调控不是由单一因子完成的而是几种因子组合发挥特定的作用。（四）、真核生物转录后水平的调控机制？答：（1）、5，端加帽和 3，端多聚腺苷酸化的调控意义：5，端加帽和 3，端多聚腺苷酸化是保持 mRNA 稳定的一个重要，它至少保证 mRNA 在转录过不被降解。（2）、mRNA 选择性剪接对表达调控的作用（3）、mRNA的控制（五）、受体的特点？答：1、高度专一性；2、高度亲和性；3、可逆性；4、可饱和性；5、特定的作用模式（六）、表皮生长因子介导的信号传导途径？答：表皮生长因子受体是一个典型的蛋白酪氨酸激酶受体，这个信号转导途径的主

37、要步骤是： 1、 受体二聚化的形成及其磷酸化：表皮生长因子与受体的结合使受体发生二聚化，从而改变受体构象，使蛋白酪氨酸激酶活性增强，受体自身的几个蛋白酪氨酸残基在激酶的作用下发生磷酸化。 2、 募集接头蛋白 Grb2：表皮生长因子受体自身被磷酸化后，不仅其激酶活性增强，而且其构象发生变化，从而适合与含 SH2 结构域的蛋白分子相结合。Grb2 是作为接头蛋白结合到受体上。 3、调控分子 SOS 的活化：SOS 含有可与 SH3 结构域相结合的富含脯氨酸基序，当 Grb2结合到磷酸化的表皮生长因子受体后，它的两个 SH3 结构域即可结合 SOS，使之活化。 4、 低分子量 G 蛋白 Ras 的活

38、化：SOS 可促进RasGDP，结合GTP 的反应，使Ras 激活。活化的Ras 作用其下游分子Raf，使之活化。Raf 是 MAPK 级联反应的第一个分子，由此启动了 MAPK 的三级激活过程。 5、 MAPK 的级联激活：Raf是一种 MAPKKK，它作用于 MEK，使之磷酸化而激活，活化的 MEK 在作用于 MAPK的 ERK1，使之磷酸化激活由此完成了三级激活。 6、 转录因子的磷酸化及转录调控作用：活化的 ERK 可以转至细胞核内，使某些转录调控因子发生磷酸化，从而影响的转录。（七）、c信号转导途径？答：1、组成：胞外信息分子（主要是胰高血糖素、肾上腺素和促肾上腺皮质激素），受体，G

39、 蛋白，AC，c, PKA。 2、途径： ? 信号分子与受体结合，引起受体构象变化 ? 受体活化 G 蛋白 ? 活化后的G 蛋白激活腺苷酸环化酶（AC） ? AC 催化ATP 生成 c? c活化 PKA，PKA使目标蛋白磷酸化，调节代谢酶的活性或调节的表达（八）、IP3-Ca2+信号途径：?信号分子与受体结合，引起受体构象变化 ? 受体活化G 蛋白 ? 活化后的G 蛋白激活PLC ? PLC 水解PIP2 生成IP3 和DG ? IP3 使钙通道打开，细胞内 Ca2+升高 ? Ca2+与 CaM 结合，激活 Ca2+-CaM 依赖的蛋白激酶 ? Ca2+-CaM 依赖的蛋白激酶使目标蛋白磷酸化

40、。（九）、分子克隆中常用的工具酶及良好载体的条件？答：（1）、常用的工具酶 1、 限制性核酸内切酶：是细菌产生的一类能识别和切割双链 DNA 分子内特定的碱基顺序的核酸水解酶。 2、 DNA 连接酶：将两段 DNA 分子拼接起来的酶。3、 DNA 聚合酶：催化单核苷酸链延伸。 4、 逆转录酶：依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶，这是一种有效的转录 RNA 成为DNA 的酶，产物 DNA 又称互补 DNA。 5、 末端脱氧核糖核酸转移酶：将脱氧核糖核酸加到 DNA 的 3 末端。 6、 碱性磷酸酶：催化去除DNA、RNA 等的 5 磷酸基团。 7、 依赖DNA 的 RNA 聚合酶：识别特异性启动

41、子，RNA 转录。（2）、良好载体的条件 1、必须有自身的子；2、载体分子上必须有限制性核酸内切酶的酶切位点，即多克隆位点，以供外源DNA；3、载体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性重组子和重组子；4、载体分子必须有足够的容量；5、可通过特定的方法导入细胞；6、对于表达载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、增强子、加尾信号等DNA 调控元件。（十）、蓝-选的原理？答：某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖苷酶片段，在半乳糖苷酶的区外又另外引入了一段含多种单一限制酶位点的 DNA 序列。这些位点上如果没有克隆外源性 DN段，在质粒被导入 lac-的大肠杆菌后，质粒携带的半乳糖苷酶将正常表达，与

42、大肠杆菌的半乳糖苷酶互补，产生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物 X-gal 和诱导剂 IPTG 后，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上外源 DN段，将使 lac Z灭活，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色。由于这种颜色标志，重组克隆和非重组克隆的区分一目了然。十一）SANGER 双脱氧链终止法的原理？答：DNA 链中核苷酸以 3,5-磷酸二酯键连接，DNA 所用的底物是 2-脱氧核苷三磷酸。2,3ddNTP 与普通 dNTP 不同，它们在脱氧核糖的 3位置缺少一个羟基。在 DNA 聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA 链中，但由于没有 3羟基，不能同后续的 dNTP 形成磷酸二酯键，

43、因此，正在延伸的 DNA链不能继续延伸。在 DNA反应混合物的 4 种普通 dNTP 中加入少量的一种ddNTP，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争，产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离。在 4 组独立酶反应中分别采用 4 种不同的 ddNTP，结果将产生 4 组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的 A、C、G 或 T 位置。（十二）、核酸分子杂交的原理？答：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及在复性过个分子间键的形成和断裂。杂交的双方是待测

44、核酸和已知序列。（十三）、影响杂交的？答：1、核酸分子的浓度和长度：核酸浓度越大，复性速度越快。探针长度应控制在 50-300个碱基对为好。 2、温度：温度过高不利于复性，而温度过低，少数碱基配对形成的局部双链不易解离，适宜的温度是较 TM 值低 25 度。 3、离子强度：在低离子强度下，核酸杂交非常缓慢，随着离子强度的增加，杂交反应率增加。高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，所以进行序列不完全同源的核酸分子杂交时必须维持杂交反应液中的盐浓度和洗膜液中的盐浓度。 4、杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的 TM 值。它有以下优点：在低温下探针更稳定；能更好地保留非共价结合的核酸。 5、核酸分

45、子的复杂性：是指存在于反应体系中的不同顺序的总长度。两个不同组DNA 变性后的相对杂交速率取决于样品浓度绝对一致时的相对复杂性（即 DNA 中的碱基数）。 6、非特异性杂交反应：在杂交前应对非特异性杂交反应位点进行封闭，以减少其对探针的非特异性吸附作用。（十四）、探针的种类和优缺点？答：1、cDNA探针：通过逆转录获得 cDNA 后，将其克隆于适当的克隆载体，通过扩增重组质粒而使 cDNA 得到大量的扩增。提取质粒后分离纯化作为探针使用。它是目前应用最为广泛的一种探针。 2、组探针：从组文库里筛选得到一个特定的或片段的克隆后，大量扩增、纯化，切取片段，分离纯化为探针。 3、寡核苷酸探针：根据已

46、知的核酸顺序，采用 DNA仪一定长度的寡核苷酸片段作为探针。 4、RNA 探针：采用克隆和体外转录的方法可以得到RNA 或反义RNA 作为探针。（十五）、探针的标记法？答：1、缺口平移法：此法是利用适当浓度的 DNase 在DNA双链上随机切割单链，造成单链切口。切口处产生一个 5 末端和 3 末端，3 末端就可以作为引物，在大肠杆菌 DNA 聚合酶的催化下，以互补的 DNA 单链为摸板，依次将 dNTP 连接到切口的 3 末端的羟基上，新的 DNA 单链；同时 DNA 聚合酶的 53 的核酸外切酶活性在切口处将旧链从 5 末端逐步切除，新链不断延伸，从而使原 DNA 分子上的部分核苷酸残基被

47、标记的核苷酸所取代。 2、随机引物法：随机引物是人工的长度为 6 个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物。对于任何一个用作探针的 DN段，随机引物混合物中都会有一些六核苷酸片段可以与之结合，起到 DNA引物的作用。将这些引物与变性的 DNA 单链结合后，以 4 种dNTP（其中一种是标记物标记的 dNTP）为底物，与探针DNA 互补的切带有标记物的 DNA 探针。 3、PCR 标记法：在 PCR 反应底物中，将一种 dNTP 换成标记物标记的 dNTP， 这样标记的 dNTP 就在 PCR 反应的同时掺入到新的 DNA 链上。 4、末端标记法：只是将 DN段的一端进行标记。（十六）、PCR 的

48、基本原理？答：PCR 是在试管中进行的 DNA反应，基本原理是依据细胞内 DNA 半保留复制的机理，以及体外 DNA 分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外系统的温度，以促使双链 DNA 变成单链，单链 DNA 与人工的引物退火，然后耐热 DNA 聚合酶以 dNTP 为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR 全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行 DNA 模板解链、引物与模板DNA 结合、DNA 聚合酶催化新生 DNA 的，即高温变性、低温退火、中温延伸个步骤PCR 反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的 DNA 得以迅速扩增。DNA 模板

49、变性：模板双链 DNA?单链 DNA，94。退火：引物单链DNA?杂交链，引物的 Tm 值。引物的延伸：温度至 70 左右， Taq DNA聚合酶以种 dNTP 为原料，以目的DNA 为模板，催化以引物末端为起点的 53DNA 链延伸反应，形成新生 DNA 链。新的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板 PCR，就是如此反复循环，使目的 DNA 得到高效快速扩增。（十七）、PCR 引物设计的基本要求？答：1、引物长度一般为 1530 个核苷酸。过短影响 PCR 的特异性，过长会提高相应退火温度，使延伸温度超过 TaqDNA 聚合酶最适温度 74,影响产物的生成。 2、引物的碱基尽可能

50、随机，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。3端不应有连续 3 个 G 和 C。否则会使引物和模板错误配对。G+C含量一般占 45 -55。3端和 5端引物具有相似的 Tm 值,Tm 值计算公式：Tm4(G+C)+ 2(A+T) 3、引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。引物的连续互补序列，一般不超过 3bp。 4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3端的互补。 5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不超过 70，引物 3末端连续 8 个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。6、引物 3端碱基是延伸的起点，因此一定要与模板 DNA 配对。引物 3端最佳碱基选择是

51、G 和 C，形成的碱基配对比较稳定。 7、引物与模板结合时，引物的 5端最多可以游离十几个碱基而不影响 PCR 反应的进行。 8、引物的 5端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列包括起始子、终止子等（十八）、PCR 的反应条件？答：1、PCR 反应的缓冲液： ? Tris-HCl 缓冲液 ? KCl 促进引物的退火，浓度太高时会抑制 Taq DNA 聚合酶活性。 ? 加入 BSA 或明胶有利于保护 TaqDNA 聚合酶活性。 ? 必要时加入适量二甲基亚砜(DMSO)或甲酰胺利于破坏模板二级结构，提高 PCR 反应特异性。 2、镁离子浓度 一般

52、用量 1.5-2.0 mmol/L，Taq DNA 聚合酶活性需要 Mg 2+。Mg 2+浓度过低，会显著降低酶活性。Mg 2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg 2+浓度还会影响引物的退火、模板与 PCR 产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。3、底物浓度 工作浓度 20-200umol/L， dNTPs 浓度过高可加快反应速度，也增加碱基的错配率和实验成本。降低浓度会导致反应速度下降，可提高反应的特异性。在PCR 反应中，4 种 dNTP 必须以等摩尔浓度配制，以减少 PCR 反应的错配误差并提高使用效率。 4、Taq DNA 聚合酶 75-80时具有最高的聚合酶活性，150 个核

53、苷酸/秒；具有良好的热稳定性，95仍有活性，应用浓度一般为 1-2.5u/100ul 反应体积。 5、引物 0.1-0.5umol/L。引物浓度偏高会引起错配或非特异性扩增、生成引物二聚体，使目的 DN段产率下降。退火温度与引物 Tm 值有关，引物 Tm 值在55-80 范围较为理想。 6、反应温度和循环次数（十九）、影响大肠杆菌系统外源表达的？答：1、启动子的强弱；2、的剂量；3、影响RNA 转录和翻译效率的：SD 序列、mRNA；4、外源子的选择；5、表达产物的大小；6、表达产物的稳定性。（二十）、大肠杆菌系统表达外源必须具备的条件？答：1、要求外源的编码区不能含有内含子； 2、表达的外源

54、片段要位于大肠杆菌启动子的下游，并形成正确的阅读框架；3、转录出的 mRNA 必须有与大肠杆菌 16S rRNA3，末端相匹配的 SD 序列，才能被有效的翻译成蛋白质。 4、蛋白产物必须稳定，不易被细胞内蛋白酶快速降解，且对宿主无害。（二十一）、真核细胞表达外源的条件？答：1、首先必须具备哺乳动物细胞表达的功能元件。要求哺乳动物细胞表达载体带有能在真核细胞中表达外源的真核转录调控元件； 2、注意选择转染的受体细胞，不同类型的细胞具有不同的特性； 3、注意选择适当的选择标记。（二十二）、转动物的概念、原理及应用？答：1、概念：是指用人工方法将外源导入或整合到组内，并能稳定传代的一类动物。它的特点

55、是“分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达”。 2、基本原理：将目的或组片段用显微注射等方法注入实验动物的卵或着床前的胚胎细胞中，使目的整合到组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物的或中，使其发育成携带有外源的转动物，人们可以通过分析转和动物表型的关系，揭示外源的功能；也可以通过转入外源培育优良的动物品种。 3、应用：建立用于研究外源基因表达调控体系；建立医学中常用的疾病模型；培育动物新品种；药理学和药用蛋白的生产研究。（二十三）、敲除的基本程序？答：通过 DNA 同源重组，使得胚胎干细胞特定的内源被破坏而造成功能丧失，然后通过胚胎干细胞介导得到该丧失的小鼠模型的过程称为敲除

56、。 1、 打靶载体的构建：同源序列要足够长，要含有筛选用的标志。 2、 胚胎干细胞的体外培养 3、 打靶载体导入胚胎干细胞 4、 同源重组胚胎干细胞的筛选 5、敲除胚胎干细胞注射入胚泡 6、 胚泡植入假孕小鼠的中 7、 杂交育种获得纯合的敲除动物（二十四）、DNA 芯片的原理？答：DNA技术就是一种大规模的集成的固相核酸分子杂交，以大量已知碱基序列的寡核苷酸片段为探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性定量分析得出待测样品的序列及表达的信息。其方法包括的、样品的准备、分子杂交和检测分子。（二十五）、诱变剂的作用机制？答：1、碱基的类似物诱发突变 2、改变 DNA 的化学结构 3、结合

57、到 DNA 分子上诱发移码突变 4、紫外线及其他射线引起的 DNA 分子的变化（二十六）、突变类型及其遗传效应？答：1、突变类型： 点突变：DNA 大分子上一个碱基的变异。分为转换和颠换。 缺失：一个碱基或一段核苷酸链从 DNA 大分子上。 ：一个原来没有的碱基或一段原来没有的核苷酸链到 DNA 大分子中间。 倒位：DNA 链内重组，使其中一段方向倒置。 2、突变的遗传效应： 遗传的改变：错义突变、无义突变、同义突变、移码突变 对 mRNA 剪接的影响：一是使原来的剪接位点；二是产生新的剪接位点。 蛋白质肽链中的片段缺失：（二十七）、治疗的策略？答：1、置换或称矫正：特定的目的导入特定的细胞，

58、通过定位重组，让导入的正常置换组内原有的缺陷，不涉及组的任何改变。分子生物学试题及一、1 cDNA 与 cccDNA： cDNA 是由 mRNA 通过反转录酶的双链DNA ；cccDNA 是游离 于之外的质粒双链闭合环形 DNA 。2 标准折叠：蛋白质二级结构单元螺旋与折叠通过各种连接多肽可以组成特殊几何排列的结构块，此种确定的折叠类型通常称为超二级结构。几乎所有的三级结构都可以 用这些 折叠类型， 乃至他们 的组合型 来予 以 描述 ， 因 此 又将其 称为标准折叠。 3 CAP ：环 腺苷酸（ c）受 体蛋白 CRP （ creceptor protein ） ，c与 CRP 结合 后 所

59、形成的 复 合物称 激活 蛋白 CAP （ cactivatedprotein ）4 回文序 列： DN段上 的一 段 所 具 有的反 向互补序 列，常是限制性 酶 切位 点 。 5 micRNA ： 互补干扰 RNA 或 称反 义 RNA ，与 mRNA序 列 互补 ，可 抑制 mRNA 的 翻译 。 6 核 酶： 具 有 催化活性 的 RNA ， 在 RNA 的 剪 接加工 过起到自我催化 的 作用 。 7 模 体：蛋白质分子 空间 结构 中存在着某些形 状和拓扑 结构 颇 为类 似 的 局部区域 8 信号 肽： 在 蛋白质过 程中 N 端 有 1536 个氨基酸残基 的肽 段 ， 引导

60、蛋白质的 跨膜 。 9 弱化 子： 在区 与结构之 间 的一 段可以 终止 转录 作用 的 核苷酸序 列。10 魔斑 ： 当细菌 生 长 过， 遇 到氨基酸 全面缺乏时 ， 细菌 将 会产生一个 应急 反 应 ， 停 止 全 部的 表达 。 产 生 这 一 应急 反 应 的 信号是鸟苷 四磷 酸 (ppGpp) 和 鸟 苷五磷 酸（ pppGpp ） 。 PpGpp 与 pppGpp 的作用不只 是一 个或几 个子，而 是 影响 一 大批 ，所以称 他们 是超级 调 控子或称为 魔斑 。11 上 游 启动件 ：是 指对启动 子的 活性起到 一种 调节 作用 的 DNA序列， -10 区 的A