圆二色谱原理与应用课件

圆二色谱CircularDichroism(CD)

原理与应用圆二色谱CircularDichroism(CD)

1光的性质：波粒二象性诞生人类对光的研究起源很早，但对光本质的认识经历了一个较漫长的过程。光究竟是波还是粒子？光的波动说与微粒说之争从十七世纪初开始，其间牛顿、惠更斯、托马斯．杨、菲涅耳、爱因斯坦、波尔等多位著名的科学家努力揭开了遮盖在“光的本质”外面那层扑朔迷离的面纱，至二十世纪初以光的波粒二象性告终，前后共三百多年的时间。光的性质：波粒二象性诞生人类对光的研究起源很2粒子性：光是某种粒子即光量子，具有粒子的性质如反射，散射等现象。

波动性：即光具有波动性，有衍射、干涉等性质墨子和他的学生做了世界上最早的“小孔成像”实验，并对实验结果作出了光沿直线传播的科学解释，并用此原理解释了物体和投影的关系。爱因斯坦提出了光量子论，解释了光电现象，揭示了微观客体的波粒二重性粒子性：光是某种粒子即光量子，具有粒子的性质波动性：即光具有3光源发射光量子从演示中可以看出：光源发射的单个光量子的运动轨迹是一个轨迹为余弦函数的简谐振动轨迹方程为x＝Acos（ωt＋φ）

光源发射光量子从演示中可以看出：光源发射的单个光量子的运动轨4而真实光源向外发射的是连续的光量子如图所示:图中不同颜色的小球代表不同的光量子所有光量子在一个平面上我们称之为平面偏振光它的轨迹方程为x＝Acos（ωt＋φ）公式中A为振幅与光强度的平方成正比

φ为初始相位

t为时间而真实光源向外发射的是连续的光量子如图所示:图中不同颜色的5我们平时看到的光为自然光具有:

1.方向随机性自然光源向外发射方向性是随机的光量子2.不连续性会产生无数初始相位不同的光量子糖葫芦z

传播方向360度旋转的轨迹这两个性质决定自然光具有如图所示的性质,既自然光可以看作圆柱形向前传播的光我们平时看到的光为自然光具有:糖葫芦z传播方向360度6两束光的合成:物理力学力的矢量合成:F1F3F2物体受到的两个力F1,F2等同于物体受到这两个力的矢量合成F3光的合成也遵循矢量合成:其合成为电场矢量的合成与光强度的平方成正比两束光的合成:物理力学力的矢量合成:F1F3F2物体受到的两7xytt1t0t1t2t3t4t0t2t3t4合成平面偏振光图相互垂直的片面偏振光Φ2-Φ1=0取t0,t1,t2,t3,t4时间的截面xytt1t0t1t8Φ2-Φ1=pi/2AX=AYpi=3.141592圆偏振光x=AXcos(Wt+Φ1)y=AYcos(Wt+Φ2)xy如果AX=AY合成轨迹为圆如果AX=AY合成轨迹为椭圆垂直传播方向Φ2-Φ1=pi/2AX=AYpi=3.1419下面我们研究以下两束圆偏振光的合成:两束旋转方向相反的圆偏振光如果振幅相同（振幅与光强度的平方成正比）矢量合成为平面偏振光。如果振幅不等则根据公式合成为下图右图所示的椭圆偏振光！下面我们研究以下两束圆偏振光的合成:两束旋转方向相反的圆偏振10圆二色性e1e2e3e4e5e6e7e8晶轴垂直晶轴电气石晶体当自然光入射到电气石晶片的时,晶片强烈地吸收振动平面与晶轴垂直的光波,而只允许振动平面平行与晶轴的光波通过,因此通过晶片的光就变为具有一定平面的偏振光.各向异性的物质对不同方向的光吸收不同如图所示：圆二色性e1e2e3e4e5e6e7e8晶轴垂直晶轴电气石晶11平面不对称的分子具有各向异性如氨基酸核酸、手性分子也对偏振光有调节活性平面不对称的分子具有各向异性如氨基酸核酸、手性分子12当两束圆偏振光照射到含有这类分子的溶液时:samplesolution溶液对左旋和右旋的圆偏振光的吸收不同这会导致EL不等于ER根据我们前面对振幅不同的两束圆偏正光的叠加现象可以判断透过样品溶液的光变为一束椭圆偏振光当两束圆偏振光照射到含有这类分子的溶液时:sampleso13当溶液中的样品的结构不同,或成分不同我们可以得到不同的椭圆反过来我们可以通过检测两束旋转方向相反的圆偏振光透过样品所产生的椭圆的不同来判断样品所含的成分,和结构信息。当溶液中的样品的结构不同,或成分不同我们可以得到不同的椭圆14泰勒一阶展开式inproperunits(CDspectroscopistsusedecimol)Perresidue2)为了方便比较我们用θ来描述椭圆的信息度圆二机器测量值光谱学家一般采用摩尔椭圆率和Deltaepslon大家形成统一的单位易于比较泰勒一阶展开式inproperunits(CDspe15tan(i0)＝n2/n1时i0被称为布鲁斯特角此时的反射光为平面偏振光，利用该原理可制造起偏器。n1折射率n2折射率i0平面偏振光折射：双折射：o-raye-ray当一束光经过各向异性的晶体或其他状态的介质时产生相互垂直的两束偏振光o,e当光离开晶体时的Φ2-Φ1=2*pi*l/(n0-ne)*入四分之一波片如果l=入/4/(n0-ne)则Φ2-Φ1=pi/2此时如果入射光与光轴夹角为45度时o,e的振幅相同则o,e合成的为圆偏振光.45deg45deg光轴光轴偏振光的产生:tan(i0)＝n2/n1时i0被称为布鲁斯特角此时的16圆二色谱仪器刨面图M为镜子,p为起偏器ls代表等和水晶圆二色谱仪器刨面图M为镜子,p为起偏器17CD特点测量的θ非常小CD测量的为2.32*(AL-AR)弧度以样品有圆二信号一定要有紫外吸收但有紫外吸收不一定由远而信号CD特点测量的θ非常小18CD谱在蛋白质研究中的应用CD谱在蛋白质研究中的应用19Thepeptidebondisinherentlyasymmetric&isalwaysopticallyactive蛋白质分子的固有不对称性决定了蛋白质的光学活性蛋白质的结构的不同表现出其对圆二色性特征的差异所以我们可以通过圆二信号来测量蛋白质的结构信息Thepeptidebondisinherently20图为一些蛋白的(或肽)的标准园二谱图图为一些蛋白的(或肽)的标准园二谱图21我们以肌红蛋白为例193nm208nm223nm我们从图中看到了193,208,,223特征峰与上一图中全螺旋的蛋白的特征峰基本相同我们可以从这个信息断定我们样品的结构主要为螺旋结构我们以肌红蛋白为例193nm208nm223nm我们从图中22当我们得到一个图谱可以通过下表来和前面提到的标准图谱来判断我们样品的结构信息当我们得到一个图谱可以通过下表来和前面提到的标准图谱来判断我23对于螺旋性较高的蛋白可以通过下式初步估算螺旋的含量:但是准确性较差不推荐对于螺旋性较高的蛋白可以通过下式初步估算螺旋的含量:24——

chymotrypsin(allb)——lysozyme(a+b)——triosephosphateisomerase(a/b)——myoglobin(alla)但一般蛋白的结构信息是较复杂的并非标准的螺旋或折叠之类的结构对于这些蛋白结构的分析我们要选择合适的软件和算法进行分析——chymotrypsin(allb)但一般蛋白的结25CD谱的分析算法很多但是最主要的都是基于最小二乘法:v1v2v3v4v5v6v7v8v9v10v11v13v14v15v16.....180nm260nm△ξαHelix×a+v1v2v3v4v5v6v7v8v9v10v11v13v14v15v16.....△ξβsheet×b+v1v2v3v4v5v6v7v8v9v10v11v13v14v15v16.....△ξ×c=测量的样品谱v1v2v3v4v5v6v7v8v9v10v11v13v14v15v16.....△ξRandomcoila/(a+b+c)=螺旋含量b/(a+b+c)=折叠含量c/(a+b+c)=无规卷曲含量通过最最小二乘法求解出最优a,b,c的值CD谱的分析算法很多但是最主要的都是基于最小二乘法:v11826RecommendedMethodsFordeterminationofglobularproteinconformationinsolution:SELCON,CDNNandK2D.Fordeterminationofpolypeptideconformation:LINCOMBwithasuitablepolypeptidesetofreferences.Fordeterminingtheeffectsofmutations,ligandsandperturbantsonproteinstructure:LINCOMB.Forevaluatingthenumberoffoldingstatesgivingrisetoasetofspectra:TheCCAalgorithmandSVD.RecommendedMethodsFordetermi27TheProteinCircularDichroismDataBank(PCDDB)http://pcddb.cryst.bbk.ac.uk/OnLineCircularDichroismAnalysishttp://public-1.cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html/Cca分析http://www2.chem.elte.hu/cgi-bin/ccaform061122-5lyxPGDxoLsM6-00园二二级结构分析相关文献/~sreeram/PDF/index.html下载软件分析:/cdrwjweb/#InstructionsCdpro分析:定期更新:SELCON3,CDSSTR,andCONTINCLUSTER/~sreeram/CDPro/

TheProteinCircularDichroism28圆二色谱原理与应用ppt课件29圆二色谱原理与应用ppt课件30圆二色谱原理与应用ppt课件31从CD谱分析准确性对全、/和变性蛋白质的准确度90-100%对+的准确度为85%对全的准确度为75%从CD谱分析准确性对全、/和变性蛋白质的准确度9032ApplicationsofCDinstructuralbiologyDeterminationofsecondarystructureofproteinsthatcannotbecrystallisedInvestigationoftheeffectofe.g.drugbindingonproteinsecondarystructureDynamicprocesses,e.g.proteinfolding

Studiesoftheeffectsofenvironmentonproteinstructure

Secondarystructureandsuper-secondarystructureofmembraneproteinsStudyofligand-inducedconformationalchangesCarbohydrateconformationInvestigationsofprotein-proteinandprotein-nucleicacidinteractionsFoldrecognitionApplicationsofCDinstructur33CD实验要点CD实验要点34仪器操作及参数:仪器操作及参数:35NitrogenflushingFlushingtheopticswithdrynitrogenisamust:Xelamphasaquartzenvelope,soifoperatedinairit’lldevelopalotofozone,harmfulforthemirrorsbelow195nmoxygenwillabsorbradiation氮气流量15-20for>180nm>20for<180nmNitrogenflushingFlushingthe36温度:圆二信号同紫外和荧光一样对温度十分敏感

实验平行体系温度要保持一致房间空调,同时仪器控温温度:圆二信号同紫外和荧光一样对温度十分敏感37圆二色谱原理与应用ppt课件38HTplotTheHTplotisveryimportant,sincereadingsabove600-650Vmeanthatnotenoughlightisreachingthedetectorsoasampledilutionortheuseofshorterpathcellarerequired.FurthermoretheHTplotisinrealtyasinglebeamspectraofoursample,sincethereisadirectrelationbetweenHTandsampleabsorbance.BydatamanipulationHTconversionintoabsorbanceandbufferbaselinesubtractionispossible.AlternativelysinglebeamabsorbancescalecanbeusedalreadyinCH2duringdatacollection,loosinghoweverabitthealertingfunctionsofthischannel.HTplotTheHTplotisveryimp39Bandwidth(SBW)selectionSettingofslitsshouldbeaslargeaspossible(todecreasenoiselevel),butcompatibletothenaturalbandwidth(NBW)ofthebandstobescanned.AsaruleSBWshouldbekeptatleast1/10oftheNBW,otherwisethebandwillbedistorted.IfNBWisnotknownaseriesoffastsurveyspectraatdifferentSBWwillhelpproperselection.Tradeinofaccuracyversussensitivity(i.e.theuseoflargerthantheoreticalSBW)isoccasionallyrequired.2nminthefarUVregion1nminthearomaticregion(wherefinestructuresmaybepresent),optimalband-pass(aslargeaspossible,butnotloosinginformation)canbedeterminedafteratrialBandwidth(SBW)selectionSetti40Numberofdatapointdatapitch,i.e.numberofdatapointspernm,willnotdirectlyinfluencethenoiselevel.Howeverifpostrunfurtherdataprocessingwillbeappliedtoreducethenoise,it’sadvisabletocollectasmanydatapointsaspossibletoincreasetheefficiencyofthepostrunfilteringalgorithmNumberofdatapointdatapitch41AccumulationanotherwaytoimproveS/Nistoaveragemorespectra.HeretootheS/Nwillimprovewiththesquarerootofthenumberofaccumulations.Averagingisveryeffectivesinceitcompensatesshorttermrandomnoise,butit’llnotcompensatelongtermdrifts(mainlyofthermalorigin).Soiflongaccumulationsareusedwerecommendasuitablelongwarm-upofthesystemand/ortheuseofasamplealternator(tocollectsequentiallysampleandblankandaveragetheirsubtractedvalues).Forlongovernightaccumulationsit’sessentialthatroomtemperatureiswellkeptstable.Accumulationanotherwaytoimp42扫描速度和响应时间:扫描速度和响应时间对不同样品体系可能有所不同要得到较好可重复的光谱数据必须找到合适的扫描速度和响应时间.一般蛋白质扫描速度:20-100nm/min响应时间:4-8秒扫描速度和响应时间:扫描速度和响应时间对不同样品体系可能有所43样品装备样品装备442.Forstubborndirtorproteins,a)YoumayuseconcentratedHNO3,aquaregiaorotheracidwash.b)DoNOTusealkali,hydrofluoricacid,orphosphoricacidonthequartzcell.Avoidscratchingthecell.c)CleanwithdistilledH2Othensoakwith2-3%sodiumlaurylsulfateforafewminutes.Rinsethoroughly(10times)withwater,thenEtOH3times,andacetone3times.3.Aftercleaning,avoidtouchingthesamplecell.Fingerprintscancauseartifactsinthedata.1.Routinecleaning.a)Washwithwaterorsolvent.b)Washwithvolatilesolvent(e.g.,acetone),thenstreamcleandryairintothecell.Thehouseairmaycontainoilssoitisrecommendedtoavoiditortouseglassfilterinapipette.二、石英杯的清洗:2.Forstubborndirtorprotei45CircularDichroismCalibrationProcedure1cmcell.0.06%(w/v)At291nm,theresultshouldbe190.4±1%,or188.5to192.3mdeg.Thisdoesnotincludederrorinmakingthecamphorstandard.1-mmcell.0.06%18.7mdegat290.5nmand238.9mdegat192.5nmAmmoniumcamphorsulfonate:solidammoniumd-camphor-10-sulfonate,FW249.33FromKATAYAMA