细胞学实验二

1、细胞的超微结构电镜下的细胞器 College of Life Science and Technology, XINJIANG Univercity 细胞生物学模块二1实验一 超薄切片的制备及透射电镜下的细胞超微结构实验二 扫描电镜下细胞的超微结构2实验一 超薄切片的制备及透射电镜下的细胞超微结构3一、实验目的了解透射电子显微镜的基础知识。观摩超薄切片技术演示，了解透射电镜样品制备方法及过程。观察生物电镜样品，在透射电镜下识别、掌握各种细胞器的亚显微结构。 4二、实验原理 电子显微镜是以短波长的电子束为照明源，用电磁透镜成像，并与特定的机械装置、电子和高真空技术相结合所构成的现代化大型精密电子

2、光学仪器。 （一）透射电子显微镜的特点 透射电子显微镜简称透射电镜，是一种电子束透过样品而直接成像的电镜。使用段波长的入射电子束与样品作用后产生的透射电子（主要是散射电子）为信号，通过电磁透镜将其聚焦成像，并经过多级放大后，在荧光屏上显示出反映结构信息的电子图像。5 透射电子显微镜的特点是分辨率高，已接近或达到仪器的理论极限分辨率（点分辨率0.2-0.3nm，品格分辨率0.1-0.2nm）；放大倍率高，变换范围大，可从几百倍到数十万倍（最高已达到80万倍）；图像为二维结构平面图像，可以观察非常薄的样品（样品厚度为50 nm左右）；样品制备的超薄切片为主，操作比较复杂。 透射电镜适用于样品内部显

3、微结构及样品外形（状）的观察，也可进行纳米样品粒径大小的测定。6（二）透射电子显微镜的结构及作用 透射电镜由电子光学系统、真空系统和供电系统三大部分组成。 1电子光学系统：此系统包括电子枪，即电子发射源。电子枪系由阴极、栅极、阳极三个电极组成的静电系统，经50-120kV的电压加速，成为高速电子流投向聚光镜。聚光镜的作用是将电子枪中射出的电子束聚焦，以最小的损耗递送到样品上。样品室的作用是承载样品。样品室还有一个气锁装置，使在更换样品后数秒钟内即可恢复至正常工作的真空状态。7 物镜是电镜的关键部件，它决定了电镜的分辨能力，对成像的质量起决定性作用。此外还有中间镜，结构和物镜类似，作用是将经物镜

4、放大的电子像再作二级放大。位于中间镜之下的投影镜，是一个高倍率强透镜。此外就是成像的荧光屏和观察室以及照相装置。8 2真空系统：电镜的镜筒空间部分是电子束的通道，不许有任何游离的气体存在，工作时必须要保持绝对真空。真空系统通常包括机械泵、空气过滤器、油扩散泵及排气管道等部件。 3供电系统：高性能的电镜供电系统包括安全系统、总调压器、真空电源、透镜电源、高压电源及辅助电源系统。9（三）透射电镜超薄切片制备方法及基本过程 超薄切片制备样品的基本过程分为取材、固定、漂洗、脱水、渗透、聚合、切片染色等几个环节。其中固定剂通常采用锇酸或戊二醛，以树脂为包埋剂，用玻璃刀作超薄切片后，捞取在铜网上，再用重金

5、属染色法染色后即可制成观察标本。 透射电镜超薄切片样品制备还需要做支持膜的制作、玻璃刀的制作、包埋块的修正、切片的特殊染色等过程。10三、实验用品 1仪器：透射电镜，超薄切片机，玻璃刀制刀机、铜网等。 2材料：动植物样品超薄切片11四、实验内容 1观摩学习超薄切片的制备方法及基本过程。 2学习在透射电镜下观察样品的超微结构。 3. 观看透射电镜照片，了解各种不同生物体细胞的内部结构。 12五、实验步骤 在老师的指导下学习超薄切片的制备方法及基本过程，并用透射电镜观察动植物样品。13六、实验结果 在透射电镜下，可以观察到各种动植物细胞亚显微结构，如细胞膜、细胞核、线粒体、内质网、高尔基体、质体等

6、细胞器的内部细微结构。141516冠状病毒(SARS) 17七、实验注意事项 1要注意制备超薄切片的主要环节。 2要注意区分细胞的显微结构和亚显微结构。 3要注意正确使用放大率，仔细观察细胞内线粒体，内质网和高尔基体等结构。18八、实验作业 1.比较透射电镜与普通光镜的结构特点。 2.简述透射电镜的工作原理。 3.简述透射电镜观察的基本要领。 4.石蜡切片技术和超薄切片技术在方法和基本过程上有什么区别？19实验二 扫描电子显微镜样品制备及其观察20一、实验目的听取电子显微镜的有关介绍，了解扫描电子显微镜的基础知识。观摩扫描电镜生物样品制备技术演示，了解对扫描电子显微镜生物样品的基本要求、制备方

7、法及过程。了解常规扫描电子显微镜样品制备过程及原理。 21二、实验原理 电子显微镜是以短波长的电子束为照明源，用电磁透镜成像，并与特定的机械装置、电子和高真空技术相结合所构成的现代化大型精密电子光学仪器。 扫描电子显微镜简称扫描电镜，是用电视的方式成像，用极狭窄的电子束去扫描样品，即电子束在样品上做光栅运动。电子束与样品作用将会产生各种效应，其中主要是样品的二次电子发射，二次电子能产生样品表面放大的性貌像，这个像是样品在扫描时时序地建立起来的，即使用逐点成像的方法获得放大的像。22（一）扫描电子显微镜的特点 扫描电子显微镜特点是景深长，图像层次丰富，立体感强，为三维结构图像。样品制作简单，不必

8、做超薄切片，且能观察大而后的样品，因此应用范围较广，可以广泛应用于生物、非生物样品的表面及其断面立体形貌的观察。23（二）扫描电子显微镜的结构及作用 扫描电子显微镜主要由电子光学系统和显示单元组成。电子光学系统：电子光学系统由电子枪、几个磁透镜、扫描线圈以及样品室组成（实际上相当于透射电镜的照明系统，它不需要成像系统）。显示单元：显示单元包括信号的收集、放大、处理、显示与记录（即照相）部分。24（三）扫描电子显微镜的样品制备方法及过程 1扫描电子显微镜的样品制备方法 （1）表面复型法：该法是用碳、硅或火棉胶液的薄膜将标本的表面拓印下来，再在透射电镜观察印在薄膜的精细结构。此法常用于观察细胞或组

9、织的表面结构。 （2）冰冻蚀刻法：此法是先将样品快速冻结，然后在真空喷镀仪中用冷刀切小削样品，使其暴露细胞的内部结构，待切面的冰在真空下升华后，表面喷镀铂碳膜，制成表面复型膜。从真空取出后，放在蒸馏水中剥离出复型膜，再置入浓硝酸中将残留的样品溶解，经蒸馏水漂洗后打捞于铜网上，待干后于电镜下观察。此法常用于观察细胞内部结构，得到的为生动的立体浮雕图像。25 2扫描电子显微镜的样品制备过程 由于观察目的不同，除了使用相同的固定液外，扫描电子显微镜生物样品制备与透电子显微镜射有较大的差异。为了得到无损、真实而清晰的表面形貌结构，在扫描电子显微镜样品制备的全过程中都必须十分小心地保护被观察面，因此在二

10、次电子表面形貌成像工作状态下，必须满足下述四项基本要求： 26 样品的被观察面应充分的暴露出来（在所要求的二次电子图像分辨率水平上），无污染、无皱缩、无明显的人工损伤及附加结构。 镀一层均匀的重金属导电材料（金、铂、钯铱和金等），造成被观察表面的“质量密度”一致性。“厚度”即要大于等于入射点子束进入样品的扩散深度，又不能掩盖样品本身的凹凸形貌结构。同时，样品表面的二次电子发射率要高。 样品、样品与样品托之间导电性要好。 能耐受高能量的入射电子和高真空，不变形、不升华。27 在取材时，针对不同的样品、不同的观察要求，采取不同的技术，使被观察表面充分地暴露出来；脱水时，为了避免观察表面皱缩变形，设

11、计了特殊的干燥方法；此外，还必须对样品进行导电处理，在样品表面喷镀一层厚度适当、均匀的金属膜。 28三、实验仪器、材料和试剂 1仪器、用具：临界点干燥器、离子溅射仪、超声波清洗机、电吹风机、磁力搅拌器、干燥器、抛光膏、刀片、剪刀、镊子、样品盒、酒精灯、牙签、竹签、培养皿、烧杯、量筒、量杯、注射器、载玻片、脱脂棉、导电胶。 2试剂：2.5%戊二醛溶液、1% OSO4溶液、0.2mol/L PBS溶液、醋酸异戊酯、液体CO2、双蒸水。 3材料：生物样品(植物花粉、昆虫口器和附肢)29 四、实验内容 1观摩学习扫描电子显微镜的样品的制备制备方法及基本过程。 2学习扫描电子显微镜下观察样品。 3观看扫

12、描电镜照片，了解各种不同生物体细胞的表面空间结构。 30五、实验方法与步骤 在老师的指导下学习扫描电子显微镜的样品的制备制备方法及基本过程，并用扫描电子显微镜观察生物样品。扫描电子显微镜的样品的制备制备的基本过程： 1准备样品托：用抛光膏擦净样品托，然后用丙酮洗净抛光膏，电吹风吹干备用。 2取材：注意保护好被观察表面，彻底清洗干净，暴露出最佳位置。样品体积应依据观察要求及样品托大小等酌情而定。 313固定、漂洗和脱水：由于扫描电子显微镜是观察样品某一表面形貌的，所以固定时间可以比TEM短。另外，脱水时，到纯乙醇级即可。漂洗可参考TEM样品制备。4用醋酸异戊酯置换乙醇：弃去乙醇，用醋酸异戊酯与纯

13、乙醇1：1的混合液浸10-20min。弃去混合液进入纯醋酸异戊酯，浸10-20min。32 5CO2置换醋酸异戊酯及临界点干燥：从纯醋酸异戊酯中取出样品，保持湿状态时置入临界点干燥仪(critical point dryer) 的样品盒并放入样品室（预冷）。盖紧样品室，充入液体CO2，液面高出盒面。缓慢排出气体CO2气体。直至样品保持湿润、周围有少量液体CO2为止。重复充液排气2-3次。然后，向样品盒内注入液体CO2（高度不超过80%），加热、加压、排气。取出样品放入干燥器内备用。临界点干燥是利用水和气的临界状态下表面张力为零的特性，使样品中的液体气化而干燥，避免了表面张力对结构的破坏。33

14、6黏贴样品：用少量导电胶涂在样品托上，用镊子轻夹样品侧面，观察面朝上置于样品托上。 7离子溅射镀膜：把样品托插入离子溅射仪真空实样品台上，操作溅射仪，可使样品表面覆盖一层1015nm厚的金属膜。溅射镀膜的基本原理是，高能粒子轰击金属靶（金、铂、钯铱和金等），靶金属原子获能后由靶表面逸出而沉积在样品表面，形成连续的导电膜。这种金属膜不仅可以导电，受激产生较强的二次电子发射，而且使样品表面具有“质量厚度”的一致性。严格地控制膜的厚度，是获得清晰、真实的二次电子表面形貌成像效果的重要条件。34六、实验结果 在扫描电子显微镜下，可以看到各种生物样品的表面及其断面立体形貌。35Figure 3. Cel

15、ls in culture. Scanning electron micrograph of rat fibroblasts growing on the plastic surface of a tissue-culture dish. (Courtesy of Guenter Albrecht-Buehler.) 36Figure 4. A scanning electron micrograph of human red blood cells. The cells have a biconcave shape and lack nuclei. (Courtesy of Bernadette Chailley.) 37叶蓟属植物火球状花粉38苍蝇复眼的扫描电镜图 39支气管上皮细胞及其纤毛 40