疟疾基因诊断技术

1、疟疾基因诊断技术阮 卫浙江省疾病预防控制中心1 疟疾诊断是疟疾控制的基础，只有及时、准确地对疟疾病例作出诊断，才能对疟疾病例进行及时、正确、规范的治疗。2疟疾诊断包括： 1、临床病例诊断 2、实验室诊断 依据WHO的标准，实验室诊断是疟疾病例确诊的基础。3 第一部分 病原学诊断 （疟原虫显微镜血片检查） 第二部分 免疫学诊断 （IFA、Opti-Mal试剂卡） 第三部分 基因诊断 （PCR） 4基因检测技术 （一）特点1、高度敏感性：疟原虫基因检测敏感性显著高于疟原虫显微镜血片检查和一些免疫诊断方法。2、高度特异性：疟原虫基因检测特异性也显著高于疟原虫显微镜血片检查和免疫诊断方法。3、需较高的

2、实验条件和技术：要有符合标准的实验室，专门的PCR仪和有经验的专业技术人员。5（二）应用范围1、特殊病例样本的检测：（1）大批量低原虫密度样本的检测（居民带虫调查）（2）混合感染样本的检测 (混合流行区疟疾病例的确诊）2、特殊情况下的疟疾病例诊断：（1)非恶性疟流行区输入性重症疟疾例的确诊（2）已用过药物治疗的疟疾病例的确诊3、特殊目的疟疾病例的检测（1） 抗药性恶性疟的检测（2）疟疾流行区传染源的追踪调查64、按蚊媒介中疟原虫的检测 （1）按蚊媒介中不同疟原虫种的检测 （2）按蚊媒介中间日疟原虫不同株的检测5、媒介按蚊的基因检测（1）不同媒介按蚊种群的基因检测（2）同一媒介按蚊不同亚种、地理

3、株或基因型的基因检测7（三）检测恶性疟原虫和间日疟原虫的 复合PCR技术 （用于混合感染样本的疟原虫基因检测）8 1.基本条件 PCR操作必须具备以下基本条件： 模板核酸，102105拷贝（DNA或RNA，但RNA的扩增需先逆转录成cDNA后才能进行） 特异性寡核苷酸引物，0.20.5 mol/L 9 2.02.5 U耐热DNA聚合酶 4种0.2 mmol/L 的三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs) 合适的缓冲体系: 1050 mmol/L Tris-HCl(pH7.59.0),650 mmol/L KCl或(NH4)2SO4,1.55.0 mmoL/L MgCl2或MgSO4 温度循环数(变性、复

4、性和延伸时的温度与时间，以及循环数)10滤纸血样本 厚薄血片 PCR扩增（35 C）条件：94 45 S 55 45 S 72 60 S， Pf 206 bp 条带Pv 370 bp 条带 Pf / Pf 引物 2%琼脂糖凝胶电泳 操作流程11PCR反应大致可分为下列步骤： 模板DNA变性：在9297的高温加热下,靶DNA变性,双链解离为两条单链,这两条链均可成为杂交的模板 模板DNA与引物互补结合：按照碱基互补配对原则，设计并合成两条与各自模板DNA双链3端互补的寡核苷酸作为引物。模板DNA在高温时解链，12当温度降低时，两条引物分别与变性后的正、负股DNA链互补结合。这一步骤温度从3765

5、都有，由引物的碱基组成决定； 引物的延伸 结合于模板上的引物，在DNA聚合酶催化下，利用反应体系中的4种dNTPs为底物，按碱基互补的方式分别合成两条新的DNA链；这一步通常在72进行。13（三）疟原虫DNA提取 酚-氯仿抽提是最早使用的经典方法，而且至今仍被广泛应用。1.基本原理 首先洗涤和纯化红细胞，然后用去污剂溶解细胞膜，随后利用一些有机溶剂以变性和沉淀蛋白质来分离去除蛋白。经过蛋白分离之后，溶液中含有核酸、盐、多糖以及残留的蛋白碎片。真核生物的核酸上紧密结合一些染色质蛋白，不易分离，可在有机溶剂进行蛋白变性之前加入蛋白酶K来消化这些蛋白质。14 2. 器材 离心机、恒温水浴锅、移液管、

6、凝胶电泳设备等。 3. 试剂 磷酸盐缓冲液（PBS），含0.05%(w/v)皂素的PBS，TE缓冲液（pH 7.6），硼酸盐（TBE）缓冲液（pH 8.0），蛋白酶K（20mg/ml，TE缓冲液溶解，pH 8.0），十二烷基硫酸钠（SDS，20（w/v），TE-饱和酚（pH 8.0），氯仿，3M 醋酸钠（pH 4.5），乙醇（99和75），琼脂糖，DNA分子标记物，溴化乙啶（EB），发热患者血样。15 4. 步骤 转移血样至一无菌试管中，800g， 离心5分钟，沉淀红细胞； 弃上清，加入5倍体积冰预冷的含0.05皂素的PBS，混匀并在冰上放置10分钟，4000g，离心5分钟，沉淀虫体； 弃上清

7、，PBS洗涤沉淀2次，用1/100初始血样体积的TE缓冲液重悬沉淀，加蛋白酶K至终浓度为20g/ml，加20 SDS至终浓度为0.5%。慢慢翻转试管几次，小心混匀，5665孵育212小时；16 加等体积TE饱和酚和等体积氯仿，翻转试管约10分钟，直至有机相和液相完全混匀，注意不要剧烈震荡，15000g，离心10分钟； 转移上层的液相至一新管中，重复酚氯仿步骤，15000g，离心10分钟； 转移液相至一新管中，加等体积氯仿，小心混匀两相5分钟，15000g，离心5分钟；17 转移液相至一新管中，加1/10体积的3mol/L 醋酸钠（pH 4.5）及2.5倍体积的99乙醇, 翻转试管几次使溶液完全

8、混合,-20放置不少于1小时，15000g，离心10分钟； 弃上清，加500-1000l 70冰预冷酒精，快速混悬试管，15000g，离心10分钟； 去上清，DNA沉淀空气干燥片刻，TE溶解至浓度约为0.5-1mg/ml；0.5%琼脂糖凝胶DNA的抽提效果； 获得的DNA于-20储存备用。18 5.注意事项 （1） 在疟原虫DNA提取过程中，要注意避免因剪切力引起的DNA断裂，不要剧烈混匀或混悬样品，用移液枪头时应剪掉枪尖的顶部，用巴氏移液管时去掉移液管的尖细的末端。 （2） 有时很难全部吸出粘稠的液相，此时，宁可浪费部分DNA，也不要吸出液相与有机相交界面的任何物质，以免降低DNA的纯度。

9、（3） 在DNA沉淀干燥步骤中，不要使其过于干燥，否则DNA沉淀很难溶解。19 如果在制备过程中获得DNA样品产量较高，可能需要花费较长时间溶解，不要通过反复抽吸或混悬来加速这一过程。把密闭的试管于65孵育过夜，DNA在这一温度绝对安全，并能稳定溶解。 如果从疟疾病人血样中提取DNA，人DNA的污染是不可避免的。对于PCR、DNA杂交等大多数应用来说，这种污染对结果不会有很大影响。但对有些应用，如建立疟原虫基因组文库，这种污染的后果可能是很严重的。此时，可通过密度梯度离心等方法从血样中分离淋巴细胞，以尽可能减少人DNA的含量。20 提取的DNA中可能含有一定数量的RNA，如果需要去除RNA的污

10、染，加无DNA酶的RNA酶A至终浓度为1mg/mL（溶于10mmol/Lol/L Tris-HCl, pH 8.0中），37孵育1-2小时，然后再重复前面所提到的酚抽提步骤。214.标准的PCR扩增程序为： 于0.5ml容量的微量离心管（或PCR反应管）中设置的反应混合物体系，依次加入：10PCR缓冲液（1/10体积），dNTPS各200 mol/L，引物各1mol/L，DNA模板102105拷贝，ddH2O补至终体积（50 l），混匀后离心15秒，使反应成分集于管底加石蜡油2050 l覆盖于反应物表面以防蒸发；用有热盖的PCR仪，不用加石蜡油。置反应管于97，变性7分钟（染色体DNA）或5分钟（质粒DNA） 22置冰上冷却，点动离心。加入13 U的TaqDNA聚合酶 于变性温度下（94）使模板DNA变性一适当时间（12分钟）在退火温度下（5060）使引物与模板杂交（退火）一定时间（0.52分钟） 在复性温度下（72 ）使复性的引物延伸合适的时间（12分钟） 重复46步骤2531次，每次即为一个PCR循环 用琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物23复合PCR扩增与结果分析 PCR反应体系Tris-HCl(10mM) 150MMgCl2(3mM) 150MdNTP 各 150MPF引物 0.25 MPV引物 1.5 MTaq