美洲大蠊提取物黏糖氨酸对肝纤维化模型大鼠的影响及机制

1、美洲大蠊提取物黏糖氨酸对肝纤维化模型大鼠的影响及机制 中国组织工程研究 第20卷 第27期 20160630出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research June 30, 2016 Vol.20, No.27 www. CRTER.org 研究原著 陈一晖，马得宏，李 武，刘丽辉，王宏图，张 禄，徐雪美，冉慧粉，钱忠义 (昆明医科大学第一附属医院，云南省昆 23 明市 650032；西双版纳傣族自治州人民医院，云南省西双版纳傣族自治州 666100；昆明医科大学病理教研室，云南省昆明市 650032) 引用本文：陈一晖，马得宏，李武，刘丽辉

2、，王宏图，张禄，徐雪美，冉慧粉，钱忠义. 美洲大蠊提取物黏糖氨酸对肝纤维化1 2 1 1 1 1 1 1 31 模型大鼠的影响及机制J.中国组织工程研究，2016，20(27): 4055-4060. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.27.015 ORCID: 0000-0001-5821-3234(李武) 文章快速阅读： 文题释义： 转化生长因子：是属于一组新近发现的调节细胞生长和分化的转化生长因子超家族，此家族除转化生长因子外，还有活化素、抑制素、缪勒氏管抑制质和骨形成蛋白。转化生长因子的命名是根据这种细胞因子能使正常的成纤维细胞的表型发生转化，即在表

3、皮生长因子同时存在的条件下，改变成纤维细胞贴壁生长特性而获得在琼脂中生长的能力，并失去生长中密度信赖的抑制作用。 肝纤维化：是多种原因引起的慢性肝损害所致的病理改变，表现为肝内细胞外间质成分过度异常地沉积，并影响肝脏的功能，是慢性肝病发展到肝硬化必经之阶段。现认为肝纤维化尚有逆转至正常的可能，而肝硬化则否。目前研究的重点放在分子与分子、分子与细胞及细胞与细胞间的相互作用方面，在诊治方面虽然有一些进展，但仍缺乏确定有效的药物。 摘要 背景：慢性肝病肝纤维化是可逆转的。有研究表明，美洲大蠊提取物具有一定的抗纤维化作用，其对实验性肝纤维化大鼠起保护作用。 目的：观察美洲大蠊提取物黏糖氨酸治疗大鼠肝纤

4、维化效果，初步探讨黏糖氨酸抗肝纤维化的作用机制。 方法：采用猪血清诱导免疫性肝纤维化模型大鼠，同时采用0.5，0.25，0.10 g/kg的黏糖氨酸灌胃治疗，放射免疫法检测肝纤4项；免疫组织化学检测肝组织转化生长因子1、组织金属蛋白酶抑制物蛋白表达强度和阳性细胞率；检测不同浓度的黏糖氨酸与转化生长因子1、组织金属蛋白酶抑制物相关性。 结果与结论：美洲大蠊提取物黏糖氨酸能降低层粘连蛋白、型前胶原、型胶原和透明质酸酶水平(P 0.01)，降低转化生长因子1和组织金属蛋白酶抑制物1在肝组织的表达(P 0.9)；结果证实，美洲大蠊提取物黏糖氨酸可逆转肝纤维化的改变，其作用机制与黏糖氨酸抑制转化生长因子

5、1和组织金属蛋白酶抑制物1的表达有关。 关键词： 实验动物；肝肾损伤与修复动物模型；美洲大蠊提取物；黏糖氨酸；肝纤维化；作用机制 ；组织转化生长因子1；组织金属蛋白酶抑制物1；放射免疫法；云南省自然科学基金 主题词： 组织工程；模型，动物；大鼠 基金资助： 云南省自然科学基金面上项目(2009CD087) ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 陈一晖，1969年生，女， 云南省昆明市人，昆明医科大学毕业，副主任医师。 并列第一作者：马得宏，男 1982年生，2013年昆明医科大学毕业，硕士，主治医师。 通讯作者：李武，硕士，主任医师，昆明医科大学第

6、一附属医院，云南省昆明市 650032 中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (2016)27-04055-06 稿件接受：2016-05-18 http:/WWW. 4055 Chen Yi-hui, Associate chief physician, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China Ma De-hong, Master, Attending physician, Xishuangbanna Dai A

7、utonomous Prefecture Peoples Hospital, Xishuangbanna Dai Autonomous Prefecture 666100, China Chen Yi-hui and Ma De-hong contributed equally to this paper. Corresponding author: Li Wu, Master, Chief physician, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, C

8、hina www. CRTER.org Effects and mechanisms of Periplaneta americana extract sticky sugar amino acid on a rat model of hepatic fibrosis Chen Yi-hui1, Ma De-hong2, Li Wu1, Liu Li-hui1, Wang Hong-tu1, Zhang Lu1, Xu Xue-mei1, Ran Hui-fen1, Qian Zhong-yi3 (1First Affiliated Hospital of Kunming Medical Un

9、iversity, Kunming 650032, Yunnan Province, China; 2Xishuangbanna Dai Autonomous Prefecture Peoples Hospital, Xishuangbanna Dai Autonomous Prefecture 666100, China; 3Department of Pathology, Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China) Abstract BACKGROUND: Hepatic fibrosis in c

10、hronic liver disease can be reversed. Studies have shown that Periplaneta americana extract has anti-fibrosis effect, and has protective effect on the experimental hepatic fibrosis rats. OBJECTIVE: To observe the effect of Periplaneta americana extract sticky sugar amino acid on hepatic fibrosis, an

11、d to primarily explore the mechanism of sticky sugar amino acid against hepatic fibrosis. METHODS: Rat models of immune hepatic fibrosis were induced by pig serum and intragastrically administered 0.5, 0.25, 0.10 g/kg sticky sugar amino acid. Four indexes of hepatic fibrosis were detected by radioim

12、munoassay. Immunohistochemical staining was used to measure transforming growth factor beta 1, tissue inhibitor of metalloproteinase protein expression intensity and positive cell rate, to determine the correlation of different concentrations of sticky sugar amino acid, transformation growth factor

13、beta 1 and tissue inhibitor of metalloproteinase. RESULTS AND CONCLUSION: (1) The Periplaneta americana extract sticky sugar amino acid reduced the levels of laminin, type III procollagen, type IV collagen and hyaluronidase (P 0.01) and reduced the expression of transformation growth factor beta 1 a

14、nd tissue inhibitor of metalloproteinase 1 in liver tissue (P 0.9). (3) Results confirmed that the Periplaneta americana extract sticky sugar amino acid can change the reversal of hepatic fibrosis. Its mechanism of action is associated with expression of transforming growth factor beta 1 and tissue

15、inhibitor of metalloproteinase 1 inhibited by sticky sugar amino acids. Subject headings: Tissue Engineering; Models, Animal; Rats Funding: the General Program of Natural Science Foundation of Yunnan Province, No. 2009CD087 Cite this article: Chen YH, Ma DH, Li W, Liu LH, Wang HT, Zhang L, Xu XM, Ra

16、n HF, Qian ZY. Effects and mechanisms of Periplaneta americana extract sticky sugar amino acid on a rat model of hepatic fibrosis. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(27): 4055-4060. 0 引言 Introduction 随着细胞生物学、分子生物学的深入研究，已证实慢性肝病肝纤维化是可逆转的。有研究表明美洲大蠊提取物具有一定的抗纤维化作用，其对实验性肝纤维化大鼠起保护作用，但缺少美洲大蠊提取物对大鼠肝纤维化

17、的治疗效果及作用机制。 肝纤维化是各种慢性肝病所共有的病理过程，是慢性肝炎向肝硬化发展的中间状态。不同致病因子持续地对肝脏细胞进行慢性损伤，激活肝星状细胞，造成肝内以胶原为主的细胞外基质成分合成增多，降解相对不足，在肝内过度沉积则会导致肝纤维化。严重的肝纤维化就发展成肝硬化、肝癌，可严重影响肝脏功能，产生多种并发症，甚至危及生命 4-5 3 2 1 次实验研究的黏糖氨酸提取自美洲大蠊，该昆虫为有翅亚纲外生翅类蜚蠊目，即蟑螂，最早以药用记载是在神农本草经，性寒、味咸，能破积聚、寒热，治疗血瘀等症。肝龙原药在临床研究中被发现治疗慢性乙肝有效率可达84.2%，药物中的美洲大蠊提取物-黏糖氨酸为主要有

18、效制剂，对损伤的肝脏有很好的保护作用，对雏鸭模型中乙型肝炎病毒进行抑制 7-8 6 。 实验采用猪血清诱导大鼠免疫性肝纤维化模型，探讨美洲大蠊提取物黏糖氨酸经口灌胃抗肝纤维化的作用。免疫性肝纤维化实验模型经济、操作简单、可靠，动物模型给动物造成的损伤较小，动物生长状态较好，具有良好的稳定性，适合用在抗原体复合物引起的肝脏纤维化防治、用药研究中。肝纤维发生机制与免疫反应相关，因此建立免疫性肝纤维模型研究肝脏纤维化防治较以往使用的化学中毒模型更可靠 9-12 。随着分子生物学、细胞 生物学等研究深入，医学界在抗肝纤维化方面取得突破性进展，转变了以往肝纤维化无可逆转的传统观念。此 。 4056 P.

19、O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org CRTER.org 正常组 模型组 黏糖氨酸高剂量组 黏糖氨酸中剂量组 黏糖氨酸低剂量组 转化生长 因子1 组织金属 蛋白酶抑制物1 图2 各组大鼠肝组织转化生长因子1和组织金属蛋白酶抑制物1的表达(免疫组织化学染色，200) Figure 2 Expression of transforming growth factor 1 and tissue inhibitor of metalloproteinase 1 in the rat liver of each group (immunohistoche

20、mistry, 200) 图注：美洲大蠊提取物黏糖氨酸能降低转化生长因子1和组织金属蛋白酶抑制物1在肝组织的表达。 实验通过建立大鼠免疫性肝纤维化模型初步阐明黏糖氨酸抗肝纤维化作用的机制，为黏糖氨酸用于防治肝纤维化提供科学的实验和理论依据。 技有限公司提供)0.5 mL，2次/周，造模当日即开始灌胃，1次/d，连续灌胃13周，给药时间共13周，造模期间给药组分别按照黏糖氨酸(昆明赛诺制药有限公司提供)高、中、低剂量(0.50，0.25，0.10 g/kg)灌胃 13-14 ，大鼠灌胃 1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 随机对照动物模型实验。 1.2 时间

21、及地点 于2012年3月至2013年10月在昆明医科大学天然药物药理重点实验室完成。 1.3 造模动物 SPF级雄性SD大鼠50只，鼠龄三四周，体质量120-150 g，由云南省药物研究所提供，动物许可证号：SYXK(滇)K2012-0001。 1.4 造模方法 将50只雄性SD大鼠随机分为5组，即正常组、模型组、黏糖氨酸高、中、低剂量组，除正常组外，其他各组分别于大鼠腹腔注射猪血清(上海雷浩科 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 针，型号0(0.00)，正常组和模型组每日按0.2 mL/10 g体质量灌胃蒸馏水，造大鼠免疫性肝纤维化模型，实验过

22、程中观察动物的体质量、食欲、神态等一般状况。连续灌胃13周后，麻醉后处死动物，常规检测肝功能；留取肝脏组织，进行染色；放射免疫法检测肝纤4项；免疫组织化学检测肝组织转化生长因子1、组织金属蛋白酶抑制物蛋白表达强度和阳性细胞率。 1.5 造模成功的检测标准 病理组织学检查肝组织，进行石蜡包埋后用组织切片机(湖北孝感亚光医用电子研究提供)切成厚度4 m的组织切片，再通过Masson 4057 ， 进行炎症活动度分级及肝纤维化分期，有2期以上肝纤 维化形成，即确定肝纤维化造模成功。 1.6 免疫组织化学染色法检测大鼠肝组织转化生长因子1和组织金属蛋白酶抑制物1的表达 肝组织包埋后切成厚度4 m的组织

23、切片，常规脱蜡、水化；体积分数3%H2O2阻断内源性过氧化物酶；热修复抗原；滴加一抗，4 过夜，PBS漂洗3次；滴加HRP生物素标记的第二抗体，室温孵育30 min，PBS漂洗3次，DAB染色，苏木精复染，无水乙醇脱水透明、封固。 结果分析：在200倍显微镜下观察切片，随机选择5 个视野，以棕色或棕褐色染色为阳性，以细胞无棕褐色或与背景一致的极淡的棕色为阴性。任取各个切片5个视野阳性细胞的百分数并平均，获取各个切片的平均阳性细胞百分率。用染色强度和阳性细胞率2项指标综合评价阳性强弱，染色强度评分：阴性为0分，弱阳性为1分，中度阳性为2分，强阳性为3分；阳性细胞百分比评分：10%阳性细胞为0分，

24、10%阳性细胞率25%为1分，25% 50%阳性细胞为3分 16-18 。染色强度和阳性细胞百分比评分 结果相加，3分为+，4分为+，5分以上为+19 ，染色 阳性率即每组阳性结果大鼠数量和每组大鼠的总数百分比。 1.7 主要观察指标 采用放免法(肝纤维化放免试剂盒，由北京北方生物技术研究所提供)测定血清层粘连蛋白、型前胶原、型胶原和透明质酸酶水平。采用全自动生化分析仪(飞利浦，型号AU5421)测定转化生长因子1和组织金属蛋白酶抑制物1的表达。 1.8 统计学分析 实验数据用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料用x_ s表示，计数资料用百分率表示，组间均数差异的比较采用单因素方差分

25、析法检测，采用Pearson相关性分析法分析转化生长因子1与组织金属蛋白酶抑制物1的相关性，P 0.05为差异有显著性意义。 2 结果 Results 2.1 实验动物数量分析 实验中50只大鼠均进入结果分析。干预流程见图1。 2.2 模型稳定性 经切片检查模型组肝细胞结构排列紊乱，门管区及纤维间隔内间质细胞和基质明显增多， 4058 www. CRTER.org 纤维向肝小叶内伸展，与临近汇管区相连，大部分形成粗细不均的细胞性间隔分割肝小叶，包绕肝实质，小叶中央静脉或缺如，或偏位，有的则有2个以上。肝细胞变性和坏死，多为水样变性及气球样变性，假小叶内的肝细胞萎缩、气球样变、脂肪样变等病理改变

26、。中央静脉周围的肝细胞气球样变形明显，中央静脉及汇管区周围的肝细胞坏死，伴有中性粒细胞及淋巴细胞浸润，细胞团内细胞排列紊乱。模型组会出现精神萎靡、活动减少、皮毛皱而不洁、进食及饮水量减少，并且后期出现肝组织损害严重，肝细胞肿胀、变性，增生的胶原纤维形成纤维分隔，破坏肝小叶结构，部分形成假小叶。 该模型方法克服了化学造模法中同动物经相同剂量化学毒物处理后出现的肝纤维化程度个体差异较大，因而组织学和病理生理学表现也不一致，加大了判断的难度化学毒物毒性剧烈，若剂量和给药方式掌握不当，模型死亡率很高的缺点，该方法模型更稳定，并且停止造模后有一定的自然恢复过程，较适合做药物的干预实验；克服了乙醇造模法对

27、发病过程及病理与其他疾病所致肝纤维不同且肝损伤的分子机制仍不十分清楚，肝纤维化程度较轻，不易发展为肝硬化、且实验技术要求较高，推广应用尚需进一步改进，使肝纤维化程度加重等缺点，该方法更接近人类疾病模式，具有转化医学意义。 2.3 黏糖氨酸对肝纤维化模型大鼠肝纤4项指标的影响 黏糖氨酸各剂量组血清中层粘连蛋白、型前胶原、型胶原和透明质酸酶水平均明显低于模型组，黏糖氨酸高、中剂量组的层粘连蛋白、型前胶原、型胶原和透明质酸酶水平低于低剂量组(P 0.05；表1)。 2.4 各组大鼠肝组织转化生长因子1和组织金属蛋白酶抑制物1的表达 免疫组织化学染色结果显示，模型对照组转化生长因子1大量表达，主要分布

28、在门静脉、汇管区、纤维间隔等纤维化区，以及肝小叶周围远离小叶中央静脉处。其他各组阳性表达面积与模型对照组相比均降低(P 0.05)，尤以黏糖氨酸高、中剂量组降低明显(P 0.9；图2，表2)。 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org CRTER.org _ 表1 黏糖氨酸对肝纤维化模型大鼠肝纤4项指标的影响 (xs，n=10，g/L) Table 1 Effects of sticky sugar amino acid on four indexes of hepatic fibrosis in a rat model of hepatic

29、fibrosis 组别 正常组 透明质酸 100.1238.34 245.0753.67 127.9849.68b 123.1445.01b 162.1268.51b a 层粘连蛋白 75.7720.04 126.1314.3 76.9012.04 b 77.8714.1 b 98.7819.3 b a 型前胶原 85.5715.21 133.4411.43 82.7614.42 b 83.3111.25 b 100.6313.54 b a 型胶原 45.329.82 80.5716.43 a 51.9410.84 b 52.5812.45 b 78.2713.23 b 模型组 黏糖氨酸高剂量

30、组 黏糖氨酸中剂量组 黏糖氨酸低剂量组 表注：与正常组比较，aP 0.01；与模型组比较bP 0.01。 表 2 各组大鼠肝组织转化生长因子1和组织金属蛋白酶抑制物1蛋白染色结果比较 Table 2 Comparison of staining results of transforming growth factor 1 and tissue inhibitor of metalloproteinase 1 in the rat liver of each group 蛋白 组别 染色强度(n) 阳性 - + + + 率(%) 转化生长 正常组 8 2 0 0 20 因子 1 模型组 1 1

31、 3 5 90a 黏糖氨酸高剂量组 7 2 1 0 30b 黏糖氨酸中剂量组 8 2 0 0 20b 黏糖氨酸低剂量组 4 2 3 1 60b 组织金属蛋白 正常组 7 3 0 0 30 酶抑制物 1 模型组 1 2 3 3 90a 黏糖氨酸高剂量组 6 3 1 0 40b 黏糖氨酸中剂量组 6 1 1 2 40b 黏糖氨酸低剂量组 5 4 1 50b 表注：与正常组比较，aP 0.05，与模型组比较，bP 0.01。 3 讨论 Discussion 大量研究证据表明，在纤维化发展过程中，转化生长因子1通过正反馈刺激肝星状细胞自分泌转化生长因子1，加强刺激肝星状细胞合成胶原，导致肝纤维化的持续

32、发展21-23 。基质金属蛋白酶生成及组织金属蛋白酶 抑制物表达的变化是决定肝纤维化进展和逆转的关键 因素 24-26 。随着肝纤维化的发展，组织金属蛋白酶抑制 物1进行性升高，通过与基质金属蛋白酶1特异性结合，使基质金属蛋白酶1活性逐渐下降，抑制，型胶原等细胞外基质的降解，从而导致在肝脏内的过度沉积，加速肝纤维化进程 27-30 。所以此次造模实验通过免疫组 织化学法检测转化生长因子1和组织金属蛋白酶抑制物1在医学生物领域具有非常重要的意义。 近年来关于美洲大蠊药用价值的研究越来越多，证实了美洲大蠊提取物能抗肿瘤、改善血液循环、提高机体免疫力、促进组织修复、抗氧化、抗病毒和抗炎等作 ISSN

33、 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 用 31 。美洲大蠊醇精制成的“心脉隆注射液”能有效强 心升压，兴奋呼吸、改善微循环，增加肺、脑、肾、心等的血流量 32-33 。由美洲大蠊醇精制的“康复新”在多年 临床应用中被发现能促进烫伤、烧伤处愈合，在十二指肠扩眼干、溃疡性结肠炎等方面有良好疗效。美洲大蠊虫粉能提高低环磷酰胺免疫力的小鼠模型中的血清溶血素水平、吞噬细胞吞噬指数和外周血CD4/CD8。黏糖氨酸是从美洲大蠊中提取的中药成分，通过多途径、多环节，多靶点、多种细胞因子及细胞内信号分子的网络来发挥药物效应。 近来有研究表明黏糖氨酸对肝损伤有较好的保护作用。

34、黏糖氨酸在逆转肝纤维化方面的研究较少，此次结果表明黏糖氨酸在免疫性肝纤维化大鼠模型中能降低肝纤四项水平，转化生长因子1和组织金属蛋白酶抑制物1水平较模型组有不同程度降低，特别是高、中剂量黏糖氨酸抗肝纤维化作用更加明显。转化生长因子1与组织金属蛋白酶抑制物1蛋白表达水平与黏糖氨酸剂量呈负相关，实验推测黏糖氨酸可能通过转化生长因子1途径或组织金属蛋白酶抑制物1途径抑制肝星状细胞的活化水平，从而减轻肝纤维化，其具体通路机制有待进一步研究。 作者贡献：文章全部作者均参加了实验的设计、实施及评估。 利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。 伦理问题：实验过程中对动物的处置符合 2009 年

35、Ethical issues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。 文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。 文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。 4059 文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。 4 参考文献 References 1 刘丽辉.美洲大蠊提取物对肝纤维化大鼠NF-B和-SMA 表达的影响J.重庆医学,2014,43(17):2152-2154. 2 王艳荣.美洲大蠊提取物对实验性肝纤维化大鼠的保护 作用J.天津医药,2013,41(12):1195-1198. 3

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