免疫电子显微镜操作方法

1、免疫电子显微镜操作方法（Pre-embedding法）所用溶液的配制方法0.4M PB贮存液注意：用超纯水（milliQ水）配制。pH=7.3-7.4Na2HPO420.6g41.2gNaH2PO4 2H2O5.2g10.4g500ml1000mlNa2HPO4 12H2O52g104gNaH2PO4 2H2O7.2g14.4g500ml1000ml流程组织的固定固定液洗净（梯度蔗糖置换）冰冻切片制作抗原抗体反应（一抗、二抗）前固定 1-2.5% glutaraldehyde （戊二醛）银增感反应（暗室）后固定（饿酸）包埋块染色（醋酸铀）酒精系列脱水树脂包埋聚合修块超薄切片电子染色观察冰冻切片

2、制作冰冻切片。厚度通常是10um冰冻切片放入切片架，用吹风机吹干（冷风。取出余下的冰冻包埋块，用铝箔纸包好，放-80度保存。吹风机30分钟以上吹干。之后开始进入抗原抗体反应步骤暂时不用的冰冻切片，放入硅胶（干燥用），完全密闭（自封袋，封口膜等）后置于80 度保存。下次使用前，升至室温后再开封（防止生成水气。抗原抗体反应用镊子将多余的冷冻包埋剂剔除。用免疫组化笔圈住组织放入0.1MPB中浸洗，室温）5分钟Blocking solution,室温）20 分钟1% BSA）10%正常血清（与二抗同种动物），0.005% saponin）0.1M PB或 5% 正常血清 + 0.2% Triton X

3、-100 + 0.1M PB抗用blocking solution稀释（约1-2ug/ml）,室温孵育1h后）4度下2-3夜。0.1M PB 4 次 x10 分钟金标二抗in blocking solution（1.4 nm colloidal gold, nano probe公司）50-100 倍稀释），室温孵育1h后）4, 2夜。（参考文献附后）下面进入银加强反应。银加强反应-包埋试剂准备：silver enhancement kit（购自 Nanoprobes ）。放入-20 度保存前，tube 内分装保存。使用当天早上从-20度冷柜中取出，至室温后使用。全程遮光。25 % gultar

4、aldehyde （戊二醛）/0.1 M PB，贮存使用。洗净二抗：0.1M PB 10min X 4次（PB绝对要使用MilliQ水。银反应过程中有Cl-不可。）a）1 % gultaraldehyde （GA，戊二醛）/0.1 M PB , RT 510 min （ 25%GA 40ul + 0.1M PB 960ul）b）洗净 0.1M PB 10min X 2 次c）洗净MilliQ水（超纯水），5min x 3次银加强反应：要准备的试剂、物品等已经从-20度升到室温的silver enhancement kit暗室（现在的显微镜室，门上遮挡，注意反锁）桌上型漩涡仪（vortexer）

5、纸毛巾（吸水，不易破）15ml试管1ml的移液器和枪头大的玻璃瓶（装废水用）玻璃瓶或烧杯（装MilliQ水或超纯水500ml-1000ml）银加强反应（暗室内进行）桌上铺上纸质毛巾（吸水性强）、注意sliver enhancement kit试剂各瓶的编号。打开安全灯。按照每张切片kit内每种液体50-100ul的量，按红、白顺序放入15ml食管，vortex。将切片上多余的水分吸干后，将切片铺在纸质毛巾上（注意防止切片干燥）步骤3的试管内加入kit内的蓝色液体，vortex。将混好的反应液4-5滴加在切片上（覆盖全组织）。反应时间各季节有所差别：冬季（室温15度以下）14-16min ;春秋

6、季（RT15-20 度）12-14min ;夏季（RT20度以上）8-10min。暗室中的温度一般情况下比较高， 冬天7-10min，夏天3-5min即可。用超纯水洗3-4分镜检。染色较淡的情况下，再进行一次增感反应。接下来的步骤需要在电镜室完成（要准备1ml移液器和枪头）。事先配制3%锇酸stock和0.2M PB stock，放入4度冰箱内保存。定（准备湿盒）：排风橱内。1.5ml EP管。3%锇酸stock和0.2M PB stock以1 : 1混合，制成1.5%饿 酸/0.1M PB。1 张切片 100ul 的量。密闭的湿盒内4度，1小时。完全密闭（parafilm封闭湿盒，再用密封袋

7、封闭）。MilliQ水（超纯水）洗净。5min x 2次。Block staining （事先配制醋酸铀和乙醇）4%醋酸铀/50%乙醇（超纯水），湿盒内4度，30min。乙醇系列脱水（50% , 70%和 80%乙醇事先放入冰箱内）50%-70%- 80%（4度下，5-10min each）-90%-95%-无水 I-无水 II-无水 III （室温，5-10min each）*此步骤非常重要，脱水不充分极易导致树脂剥离时的失败。环氧树脂包埋（配制方法见后）-20度保存的Epon，先待升至室温后使用。注意遮光、防湿。剪掉 Beem-capsule（ SPI Supplies and Struc

8、ture Probe, Inc.）的盖，用 Epon 填充。将切片放置在纸质毛巾上，擦掉切片上的乙醇。乙醇完全干燥后，向切片滴下几滴Epon注意防止切片干燥（切片上绝对不可残留乙醇）此步骤重要 将填充Epon的Beem-capsule倒立于切片上 迅速立起来。注意避免Epon 溢出。聚合仪内铺上铝箔，将切片铺好，60度，48hr。Epon的配制方法。在通风橱内先称量Epon812 RESIN （树脂），DDSA EM grade （硬化剂，量越 多，树脂越软），MNA（量越多，树脂越硬，与DMP-30 一样）。塑料容器内搅 拌（封闭，加盖）。搅拌好后，加入DMP-30，继续搅拌，约3分钟。特点

9、：Epon812可以根据样品的不同调节硬度。收缩幅度很小，对染色的效果影 响很小。保存：遮光、干燥环境下。使用后用parafilm封口，放入自封袋，-20度冰箱内保存。 解冻时特别要注意遮光。完全达到室温后取所需的量后，继续放入-20度保存。注意：Epon812对皮肤有害。注意防护。环氧树脂（EPON ）组成硬组织用(100 g)(50 g)Epon812 RESIN54.12 g27.06 gDDSA EM grade12.48 g6.24 gMNA33.40 g16.70 gDMP-301.00 g0.50 g软组织用(100 g)(50 g)Epon812 RESIN50.97 g25.

10、48 gDDSA EM grade29.37 g14.68 gMNA19.66 g9.83 gDMP-301.00 g0.50 gTAAB公司推荐Epon81248 gDDSA EM grade19 gMNA33 gDMP-302 g修块切片上用Beem-capsule包埋后，从恒温箱内取出后冷却至室温。将加热板（可用烤片机）加热至50-60度。将切片放置在加热板上，逐渐加热，从capsule的周围将刀片插入切片和树脂之间。Capsule的边缘和切片之间有一定的空隙后，将Beem-capsule放倒，连续几次重复 放倒的动作，直至将capsule取出为止。注意温度控制，过高或过低都不可。将分开

11、的Beem-capsule用台虎钳钳住、将有组织的一面用线锯切掉3mm，暴露组织。 余下的部分用裁纸刀将capsule拿掉。用光学显微镜检查，切片的位置用mark笔标记。要切掉的部分的用mark笔标记。将多余的部分用剃刀、锤子的沿着事先画好的线切掉。用aron alpha强力胶水套装（放在4度冰箱内保存）将上面修好的切片固定在树脂台 上。注意标记好样品编号。在解剖显微镜下继续修块。玻璃刀切片（暴露组织）钻石到切片电子染色：通常染色铀20 min +铅5-10 min。但是免疫电镜的情况下，为了突出染 色效果，通常只染一种（铀或铅）。观察摄影Molecular Transmission Elec

12、tron MicroscopyCryoelectron MicroscopyAoki, T.; Hagiwara, H., and Fujimoto, T.: Peculiar Distribution of Fodrin in Fat-Storing Cells; Exp. Cell. Res.,234, 313-320 (1997).Boisset, N., Penczek, P., Pochon, F., Frank, J., and Lamy, J. Three-dimensional reconstruction of human alpha 2-macroglbulin and r

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17、ctron microscopic localization of protein L7/L12 within the Escherichia coli 70S ribosome by difference mapping and Nanogold labeling. J. Biol. Chem.,e-publication ahead of print.o Abstract (html) (courtesy of the Journal of Biological Chemistry).o Manuscript as submitted (PDF) (courtesy of the Jour

18、nal of Biological Chemistry).Wagenknecht, T,; Berkowitz, J.; Grassucci, R.; Timerman, A. P., and Fleischer, S.: Localization of calmodulin binding sites on the ryanodine receptor from skeletal muscle by electron microscopy. Biophys. J.,67, 2286-2295 (1994).Wilkens, S. and Capaldi, R.A. Monomaleimido

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