细胞的冻存、复苏

1、细胞冻存与复苏上海日泰生物部2012年11月1细胞的冻存和复苏的必要性1.细胞冻存 细胞冻存与细胞传代保存相比优势在于：一，可以减少力、经费投入，减少污染，减少细胞生物学特性变化；二，有利于保存那些不立即使用的细胞系或者将细胞系转给其他使用者。22.细胞复苏 在体外培养工作中，常要将体外培养物进行冷冻保存，在需要时再复温融解进行体外培养（复苏）。3细胞冻存复苏的原理为使细胞复苏时存活率最高最佳的冻存条件： 尽可能地降低细胞内的晶体形成，减小细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的损伤。A) 缓慢冷冻B) 用亲水的低温保护剂排除水分C)在尽可能低的温度保存细胞D)快速复苏4细胞的冻存与复苏关键

2、因素 要获得好的冻存与复苏效果，必须了解如下几个问题：冷冻速率、复温速率、冷冻保护剂，冷冻保存温度。 5冷冻速率：慢冻复苏速率：快融冷冻保护剂：515甘油或二甲基亚砜（DMSO） 冷冻保存温度：196 （液氮）6对大多数有核哺乳类动物细胞来说，在不加冷冻保护剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活性好的冻存物。 目前冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。具有渗透性的冷冻保护剂。一般是一些小分子的物质，可以渗透到细胞内。非渗透性冷冻保护剂。一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内。 冷冻保护剂的重要性7冷冻保护剂的重要性 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高

3、，并在细胞内形成冰晶，冰晶导致细胞损伤甚至死亡。 在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点，在缓慢冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，细胞内冰晶减少，从而减少对细胞的损伤。 8冻存的原则：慢冻冻存液配制试剂名称组份百分比199/DMEM70%FBS20%DMSO10%9冻存的原则：慢冻细胞悬液制备1）取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（2106 5 106细胞/ml)2）加入1.5ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称、批号、代次和冷冻日

4、期，并做好登记。10冻存和复苏的原则：慢冻快融慢冻程序标准程序： 当温度在-25 以上时， 12 /min（4 冰箱存放30min） 当温度达-25 以下时， 510 /min（ -20 冰箱存放1.5-2h ） 当温度达-80时，可迅速放入液氮中（ -80 冰箱存放4-12h） 转入液氮罐，注意登记！ 简易程序： 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐内液体上方，30分钟后，立即投人液氮中。冻存的原则：慢冻11复苏的原则：快融复苏方法 冻存细胞的复苏以快速融化为原则。尽快度过冰晶期 复温速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说，复温速度越快越好。常规的做法是，在370C水浴中，于1-2分钟内完成复苏。复温速度过慢，细胞内往往重新形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。 12复苏的原则：快融复苏方法（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水