多聚酶链式反应扩增片段

1、关于多聚酶链式反应扩增片段第一张，PPT共四十五页，创作于2022年6月温故知新1:组成DNA分子的基本单位是什么?这些基本单位是如何连接成DNA分子的?DNA分子结构有什么特点？第二张，PPT共四十五页，创作于2022年6月12345DNA的基本单位脱氧核苷酸第三张，PPT共四十五页，创作于2022年6月OOPOHO碱基OOHOOPOHOOH碱基碱基脱氧核糖磷酸基团碱基脱氧核糖碱基脱氧核糖53脱氧核苷酸链结构简图磷酸二酯键第四张，PPT共四十五页，创作于2022年6月ATGCAGCTDNA分子的平面结构氢键5端3端5端3端第五张，PPT共四十五页，创作于2022年6月DNA分子的复制过程是怎

2、样的？DNA分子的复制需要哪些条件？温故知新2第六张，PPT共四十五页，创作于2022年6月DNA母链：提供复制的模板解旋酶：打开DNA双链4种脱氧核苷酸：合成子链的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子链ATP：为复制过程提供能量引物：使DNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸DNA复制的条件第七张，PPT共四十五页，创作于2022年6月复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。DNA复制的方向DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸第八张，PPT共四十五页，创作于2022年6月1、 DNA聚合酶特性不能从头合成DNA，只能从DNA的3端开始延伸DNA链，因此， DNA复制需要引物2、

3、DNA聚合酶作用过程当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DNA链， DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸一、基础知识（一）PCR原理：第九张，PPT共四十五页，创作于2022年6月第十张，PPT共四十五页，创作于2022年6月在80100的温度范围内， DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性3、 PCR原理当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链 PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器第十一张，PPT共四十五页，创作于2022年6

4、月第十二张，PPT共四十五页，创作于2022年6月高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化4、 Taq DNA聚合酶的应用5、 缓冲液需要为PCR反应提供的物质DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行第十三张，PPT共四十五页，创作于2022年6月PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出 6、 PCR技术的特点第十四张，P

5、PT共四十五页，创作于2022年6月 PCR过程需要的引物是RNA或DNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为2030个脱氧核苷酸7、细胞内复制和PCR不同点 PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的第十五张，PPT共四十五页，创作于2022年6月细胞内DNA的复制PCR不同点解旋解旋酶，边解旋边复制80100高温解旋，双链完全分开酶DNA解旋酶，DNA聚合酶，DNA连接酶TaqDNA聚合酶引物RNADNA或RNA能量ATP不加温度体内温和条件高温子链合成一条链连续（先导链），另一条链不连续，先合成片段，再由DNA连接酶连接（滞后链）两条子链均连续合成相同点需

6、要提供DNA复制模板四种脱氧核苷酸作为原料子链延伸的方向都是从5端到3端细胞内DNA的复制与PCR的比较第十六张，PPT共四十五页，创作于2022年6月PCR技术的原理总结利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，从而完成体外DNA分子的扩增。体外DNA复制的条件：四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、 模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。复制的方向：子链的5端向 3端延伸。第十七张，PPT共四十五页，创作于2022年6月（二） PCR的反应过程1、PCR的反应步骤PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤变性、复性和延伸变性（模板DNA解旋）模板

7、DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备2、循环过程第十八张，PPT共四十五页，创作于2022年6月靶序列靶序列PCR 循环第一步 ：加热变性第十九张，PPT共四十五页，创作于2022年6月复性（退火） 模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右， 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合第二十张，PPT共四十五页，创作于2022年6月靶序列靶序列引物 引物 53553533PCR 循环第二步 ：引物与靶序列退火第二十一张，PPT共四十五页，创作于2022年6月延伸DNA模板引物结合物在T

8、aqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链第二十二张，PPT共四十五页，创作于2022年6月靶序列靶序列引物引物53553533Taq DNA聚合酶PCR 循环第三步 ：引物延伸第二十三张，PPT共四十五页，创作于2022年6月靶序列 靶序列第1个 PCR 循环完成后 ：得到两个拷贝的靶序列第二十四张，PPT共四十五页，创作于2022年6月第二十五张，PPT共四十五页，创作于2022年6月3、30次循环后靶序列扩增的数量循环次数DNA数量1 22 43 820 1,048,57630 1,073,741,824第二十六

9、张，PPT共四十五页，创作于2022年6月二、PCR的反应过程小结5/3/3/5/5/3/引物5/3/引物变性95oC复性55oC延伸72oC5/3/3/5/第二十七张，PPT共四十五页，创作于2022年6月5引物15引物2第二次复制第一次复制55 55 5 5模板DNA55 555 5 552530 次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。第二十八张，PPT共四十五页，创作于2022年6月每个循环包括：变性 复性延伸从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地

10、复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。PCR的反应过程：第二十九张，PPT共四十五页，创作于2022年6月PCR反应条件： 稳定的缓冲液环境 DNA模板 分别与两条模板链相结合的两种引物 A、T、G、C四种脱氧核苷酸 耐热的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶 能严格控制温度变化的温控设备第三十张，PPT共四十五页，创作于2022年6月三、 PCR 的实验操作1、PCR仪（一）设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次第三十一张，PPT共

11、四十五页，创作于2022年6月PCR仪第三十二张，PPT共四十五页，创作于2022年6月微量离心管微量移液器第三十三张，PPT共四十五页，创作于2022年6月1、准备2、移液（二）实验操作步骤按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂第三十四张，PPT共四十五页，创作于2022年6月过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。注意：3、混合B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。第三十五张，PPT共四十五页，创作于2022年6月将离心管放入PCR

12、仪上，设置好PCR仪的循环程序。过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。4、离心5、反应离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。第三十六张，PPT共四十五页，创作于2022年6月PCR三步曲 预变性保温 变 性94 30s延伸 721min复性 5530s94 5min第三十七张，PPT共四十五页，创作于2022年6月循环数变性复性延伸预变性94，5min30次94，30s55，30s72，1min最后一次94，1min55，30s72，1min第三十八张，PPT共四十五页，创作于2022年6月PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注

13、意做到：6、注意事项隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头第三十九张，PPT共四十五页，创作于2022年6月（一）理论上DNA扩增数目的计算四、课题成果评价1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n（二）实验中DNA含量的测定1 、原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关第四十张，PPT

14、共四十五页，创作于2022年6月稀释2LPCR反应液，加入98L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零测定取DNA稀释液100L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值计算DNA含量（ g /ml ）50 (260nm的读数）稀释倍数2.过程第四十一张，PPT共四十五页，创作于2022年6月第四十二张，PPT共四十五页，创作于2022年6月比色杯第四十三张，PPT共四十五页，创作于2022年6月五、实验小结 PCR仪加热使（ ）变性, 复性使引物与模板DNA（ ）,延伸需将反应温度升至中温( ),在（ ）的作用下,以 （ ）为原料,以（ ）