浙江大学生物化学实验甲-li-2009-秋冬-酵母蔗糖酶的纯化和性质分析总结

1、精选优质文档倾情为你奉上精选优质文档倾情为你奉上专心专注专业专心专注专业精选优质文档倾情为你奉上专心专注专业离子交换分离酵母蔗糖酶一、蔗糖酶的纯化1、酵母细胞破碎称取干酵母粉15g，石英砂约5g，放入研钵中直接研磨约5分钟，取50 ml pH7.3 20mmol/L 的Tris-HCl，分5-6次加入研砵中，边加边研磨，用力研磨20分钟后，将糊状液体转移到2支50ml离心管中，平衡后，于4、12000rpm离心15分钟，收集上清，量体积V1（FI），留1ml上清（FI ）放置20冰箱保存，用于测定蔗糖酶活力、蛋白含量和SDS分析。2、热处理将上一步抽提液（FI），迅速放入50水浴中，保温30分

2、钟，其间用玻棒经常搅动，保温结束后迅速用冰浴冷却3分钟，平衡，4，12000rpm离心10分钟，收集上清，量体积V2（F），留1ml上清（F）放置20冰箱保存以备测定。3、有机溶剂（乙醇）沉淀将上清置于一烧杯中，加入等体积20预冷的95%乙醇, 冰浴中进行，慢慢滴加，边加边用玻棒轻轻搅拌均匀，注意控制在8分钟左右加完，再在冰中放置20分钟，然后转移至50ml离心管中，平衡，4，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀置于20冰箱保存，以备用于下次实验离子交换柱层析法分离纯化蔗糖酶及测定。4、DEAE-Sepharose分离纯化蔗糖酶、样品处理：将乙醇沉淀样品溶解于8-10ml pH7.3 2

3、0mmol/L 的Tris-HCl中，4 10000rpm离心10分钟，收集上清，量体积V3（F），取4.5ml（F）作离子交换柱层析进一步分离纯化蔗糖酶(可先做酶活性检测，取100ul酶液，经测酶活力很高，棕黑色）。其余置于20冰箱保存用于测定。、柱层析离子交换剂：DEAE-Sepharose，层析柱（1.020 ），洗脱液梯度：含0-0.5mol/L NaCl的pH7.3 20mmol/L的Tris-HCl，流速4ml/10min，收集：管/10min（收集到样品出完为止）。上样量：4.5ml F、过柱液（F）活性的粗测试剂空白F3F4（多管）pH4.6乙酸缓冲液（ml）1.51.41.4

4、酶液（原液，ml）00.10.150预热5min5%蔗糖（已50预热，ml）0.50.50.550反应8minDNS（ml） 111混匀，于100保温5min，取出，比较颜色深浅颜色强度 、过柱液（F）OD280的测定二、蔗糖酶的测定1、各步纯化步骤蛋白浓度的测定、蛋白质标准曲线的制作管号项 目 012345 蛋白质含量（g）50100150200250 蛋白质标准液（ml）0.20.40.60.81.0无离子水（ml）1.00.80.60.40.2Follin酚甲液（ml）5.05.05.05.05.05.0充分混匀，于（2025）放置10分钟Follin酚乙液（ml）0.50.50.50.

5、50.50.5充分混匀，于（2025）放置15分钟OD640（nm）标准蛋白质液浓度：250ug/ml、各步纯化步骤蛋白浓度的测定试管号项 目 空白（10）（5）（2）（原液）012345678稀释酶液（ml）00.10.20.10.20.10.20.10.2无离子水（ml）1.00.90.80.90.80.90.80.90.8Follin酚甲液（ml）5.05.05.05.05.05.05.05.05.0充分混匀，于（2025）放置10分钟Follin酚乙液（ml）0.50.50.50.50.50.50.50.50.5充分混匀，于（2025）放置15分钟OD640（nm）蛋白含量（mg）平均

6、值（mg，0.1ml酶液）2、各步纯化步骤酶活力的测定、葡萄糖标准曲线的制作试管号项目01234568 含糖量（mg）葡萄糖标准液（ml）0.10.20.30.40.50.60.7无离子水（ml）2.01.91.81.71.61.51.41.3 DNS试剂（ml）11111111 混匀，于100水浴中保温5分钟，取出经流动水冷却后，再加4ml蒸馏水，混匀。以0号管为对照，测定各管的OD540值。OD540葡萄糖标准液浓度：1mg/ml。、各步纯化步骤酶活力的测定试管号项目（ml空白（40）（40）（20）（10，多管）012345678pH4.6乙酸缓冲液（ml）1.51.41.31.41.31.41.31.41.3稀释酶液（ml）00.10.20.10.20.10.20.10.250预热10min5%蔗糖溶液（已预热，ml）0.50.50.50.50.50.50.50.50.5于50准确反应8分钟DNS试剂（ml）11111111 混匀，于100水浴中保温5分钟，取出经流动水冷却后，再加4ml蒸馏水，混匀。以0号管为对照，测定各管的OD540值。OD540还原糖含量（mg）平均值（mg，0.1ml酶液）酶活力（U，0.1ml酶液）蔗糖酶活力单位（U）：在一定条件下，每分钟能产生1mg还原糖的酶量三