分子生物学常用技术

1、关于分子生物学常用技术第一张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月分子生物学常用技术 凝胶电泳 分子杂交 聚合酶链反应(PCR)技术 DNA的物理图谱 DNA序列测定 基因芯片第二张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月第一节 凝胶电泳(gel electrophoresis)电泳概念基本原理 Q 6r : 迁移率 Q : 电荷量 r : 粒子半径（分子量） : 介质粘度 第三张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月电泳的用途分离鉴定纯度测定分子量凝胶电泳的种类琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 第四张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月一、琼脂糖凝胶电泳(agarose g

2、el electrophoresis) 分离核酸原理 操作要点 应用范围第五张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月（一）分离核酸原理 电荷效应 分子筛效应 分子构象第六张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月1. 电荷效应 核酸是两性电解质 pH = 3.5 , 正电荷 pH = 8.08.3 , 负电荷，正极第七张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月第八张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月2.分子筛效应 小分子移动快 ，大分子移动慢第九张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月3. 分子构象闭环超螺旋线状DNA开环DNA +-第十张，PPT共一百三十页，创作于202

3、2年6月（二）操作要点支持物 凝胶浓度的选择 DNA分子量标准 电泳缓冲液 样品制备 电泳条件 DNA电泳染色 DNA片段的回收 第十一张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月1. 支持物第十二张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月商品化的琼脂糖第十三张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月琼脂糖种类普通低熔点高纯高筛分熔点8090几十V/cm温度：1525 第二十五张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月潜水电泳第二十六张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月7.电泳染色 溴乙锭(ethidium bromide, EB) 结构及染色原理 染色方法加入凝胶液中 电泳结束

4、后染色 第二十七张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月EB染色原理第二十八张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月第二十九张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月紫外灯下显色第三十张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月8. DNA片段的回收低熔点琼脂糖法 透析袋电洗脱法(5kb) DEAE-纤维素膜法(0.55kb)第三十一张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月（三）应用范围 DNA的分离、纯化和鉴定 限制性酶切图谱分析 重组体的分离、鉴定 杂交分析 PCR产物的分离鉴定 第三十二张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月琼脂糖凝胶电泳第三十三张，PPT共一百三十页

5、，创作于2022年6月二、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 分离原理 操作要点 优点 应用范围第三十四张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月（一）分离原理 电荷效应 分子筛效应第三十五张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月PAGE支持物单体丙烯酰胺(Acr) 交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis) 催化剂过硫酸胺(AP) 加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)第三十六张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月聚丙烯酰胺凝胶第三十七张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月（二）操作要点凝胶的分类 凝胶浓度的

6、选择 凝胶液的配制 凝胶中DNA的检测DNA片段的回收 第三十八张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月1. 凝胶的分类非变性凝胶：dsDNA变性凝胶: ssDNA尿素甲酰胺SDS第三十九张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月2. 凝胶浓度的选择第四十张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月第四十一张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月3. 凝胶液的配制 试剂(ml)制备浓度(%) 3.5 5.08.0122030%Acr11.616.626.640.066.6ddH2O67.762.752.739.312.75XTBE20.020.020.020.020.010%AP0.

7、70.70.70.70.7TEMED35ul/100ml第四十二张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月PAGE装置第四十三张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月第四十四张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月第四十五张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月第四十六张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月电 泳第四十七张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月4. 凝胶中DNA的检测溴乙锭染色法 银盐染色法 甲醛 还原放射自显影法 Ag+DNA Ag（黑褐色） 第四十八张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月5.DNA片段的回收压碎浸泡法 1kb 纯度高，回收率低第

8、四十九张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月（三）PAGE优点机械强度好、化学稳定性高分辨率高 载样量大 回收的DNA纯度高 第五十张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月（四）PAGE应用范围分离、纯化和鉴定RNA和小分子DNA DNA序列分析 PCR产物鉴定 蛋白质的检测和分析 第五十一张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月第二节 分子杂交分子杂交的基本原理固相支持物探针几种常用杂交技术第五十二张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月一、分子杂交的基本原理 核酸的变性和复性第五十三张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月分子杂交DNA-DNA第五十四张，PPT共一百

9、三十页，创作于2022年6月DNA-RNA第五十五张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月杂交条件 靶分子 探针 杂交袋 杂交炉第五十六张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月杂交种类被检核酸种类和方法 原位杂交斑点杂交Southern杂交Northern杂交Western杂交 反应介质 液相杂交 固相杂交()第五十七张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月二、固相支持物 固相支持物的特性结合能力强不影响杂交反应结合牢固 非特异性吸附少 机械性能良好 第五十八张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月固相支持物的种类 硝酸纤维素滤膜 (nitrocellulose filter

10、membrane) 尼龙膜(nylon membrane)第五十九张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月1.硝酸纤维素滤膜 特点吸附ssDNA和RNA 杂交信号本底低 不足不适于重复杂交滤膜较脆 不适于电转移印迹法 对DNA小片段(缺口翻译 操作简便 DNA/cDNA 探针 第六十九张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月第七十张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月DNA的5末端标记(5end labeling) 碱性磷酸酶T4多核苷酸激酶 标记原理 制备寡核苷酸探针 制备短的DNA/RNA探针 第七十一张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月DNA的5末端标记第七十二张，

11、PPT共一百三十页，创作于2022年6月四、Southern 杂交Southern blotting/DNA blotting1975年，Edwen Southern等印迹(blotting) : 转移 blot: a spot or mark, esp. of ink blotting 第七十三张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月1. 印迹的方法 毛细管转移法 电转移法 真空转移法 第七十四张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月毛细管转移法 第七十五张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月电转移法第七十六张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月真空转移法第七十七张，PP

12、T共一百三十页，创作于2022年6月第七十八张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月2. Southern 杂交的步骤第七十九张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月3. Southern 杂交的应用基因的定性及定量分析基因的酶切图谱分析基因突变分析 RFLP第八十张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月五、Northern 杂交 RNA blotting 步骤 总RNA/mRNA变性电泳分离转移杂交放射自显影/化学显色 应用检测组织/细胞中mRNA的大小、量 比较不同组织/细胞中基因的表达情况 第八十一张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月Northern 杂交第八十二张，

13、PPT共一百三十页，创作于2022年6月六、Western 杂交免疫印迹(immunoblotting) SDS转移蛋白第一抗体标记的第二抗体(探针)检测 应用蛋白质的定性定量分析第八十三张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月第八十四张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月免疫印迹第八十五张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月 Southern,Northern & Western待测物质 支持物 探针 转移方式Southern DNANC 单链核酸 毛细管/电/真空 Northern RNANC/尼龙 单链核酸 毛细管/电/真空 Western 蛋白质NC/PVDF 抗体电转

14、移 第八十六张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月七、原位杂交(in situ hybridization)定义种类细胞内原位杂交组织切片原位杂交 基本程序 细胞/组织固定预杂交杂交冲洗 杂交信号检测 分析结果 第八十七张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月组织切片第八十八张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月第八十九张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月八、斑点杂交(dot hybridization)第九十张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月第三节 PCR技术 聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR)PCR的发展简史PC

15、R的基本原理和步骤PCR的影响因素PCR的种类PCR的应用第九十一张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月一、PCR的发展简史 1971年,Korana提出核酸体外扩增的设想 1985年, Mullis 等发明了PCR技术 1988年, PE-Cetus公司推出了第一台PCR仪 第九十二张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月二、PCR的基本原理和步骤基本原理DNA复制 三个步骤变性(denaturation) 退火(annealing) 延伸(extension) 第九十三张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月PCR的原理第九十四张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月PC

16、R的扩增产物cycle 12345n长片段 246810短片段 002822长短 21222324252n第九十五张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月标准的PCR反应体系 10X 扩增缓冲液： 10ul 模板DNA: 0.12ug 引物： 各0.21umol/L 4种dNTP: 各200umol/L Mg2+: 1.5mmol/L Taq DNA聚合酶： 2.5U 总体积： 100ul第九十六张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月第九十七张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月三、PCR的影响因素 模板 引物 Taq DNA聚合酶 4种dNTP Mg2+ 循环条件 第九十八张

17、，PPT共一百三十页，创作于2022年6月模板 DNA RNAcDNA 对模板的纯度要求低第九十九张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月引物长度：1530nt G+C含量：4060% 碱基的随机分布 避免引物自身和引物之间的互补 引物的3端 引物的5端 引物浓度：0.21umol/L 第一百张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月Taq DNA聚合酶 2.5U/100ul 20保存 最后加 第一百零一张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月底物 4种dNTP 的浓度相等终浓度：200umol/L 第一百零二张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月Mg2+ 浓度: 1.52.0

18、mmol/L 过高: 非特异扩增 过低 : 反应产物减少 第一百零三张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月循环条件变性温度和时间: 9096, 3060s 退火温度和时间: 4060, 3060sTm=4(G+C)+2(A+T) 延伸温度和时间7075 (72 )1kb, 1min; 34kb , 34min; 10kb,15min循环次数: 2535 第一百零四张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月四、PCR的种类反转录PCR原位PCR(in situ PCR)实时PCR(real time PCR)重组PCR(recombinant PCR)锚定PCR(anchored PCR

19、)反向PCR(inverse PCR)第一百零五张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月原位PCR原位杂交PCR程序 固定细胞/组织样品PCR前处理PCR扩增原位杂交及检测 第一百零六张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月实时PCR的原理第一百零七张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月五、PCR的应用分子生物学研究临床医学第一百零八张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月分子生物学研究基因克隆 DNA序列测定基因的体外定点突变 突变分析(PCR-SSCP) 基因定量 第一百零九张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月临床医学病原体诊断 遗传病的基因诊断 肿瘤检测 法医学

20、 第一百一十张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月第四节 DNA序列测定 Sanger 双脱氧链终止法(1977) Maxam-Gilbert化学裂解法(1977) 第一百一十一张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月Sanger 双脱氧链终止法 原理DNA复制 反应条件 模板引物 dNTP（其中一种带放射性标记） ddNTP DNA聚合酶第一百一十二张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月DNA的复制第一百一十三张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月2,3-双脱氧核苷酸(ddNTP)第一百一十四张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月第一百一十五张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月第一百一十六张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月DNA测序操作第一百一十七张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月DNA自动测序 第一百一十八张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月DNA自动测序仪第一百一十九张，PPT共一百三十页，创作于2022年6月