溶血素与补体激活实验报告

1、实验报告实验名称溶血素与补体激活实验日期院系专业班级姓名学号一、实验目的熟记溶血素制备的基本流程认识免疫方法对抗体产生的影响分析补体激活及生物学功能的影响因素4评价补体溶血实验的拓展与应用二、实验器材器材无菌注射器、无菌玻璃瓶、手术剪、镊子、止血带、酒精棉球、无菌棉签、天平、试管、试管架、锥形瓶、胶头滴管、废液缸、离心机、兔台、手术剪、眼科剪、注射器、烧杯、电动移液枪、水浴锅、记号笔、冰箱、镊子、平皿、200目细胞滤网、研磨棒、酒精灯、恒温培养箱试剂碘酒、灭菌生理盐水、甘油、Hanks液三、实验原理1溶血素(Hemolysin)：以绵羊红细胞(SRBC)作为抗原免疫实验动物所获得的抗体(抗-S

2、RBC),被称为溶血素。2补体(Complement)：补体系统包括30余种成分，存在于人或脊椎动物血清、组织液和细胞膜表面。是一组经活化之后才具有酶活性的糖蛋白。3补体经典激活途径大白兔产生的抗体与绵羊红细胞上抗原表位结合，抗体结构改变，暴露补体结合部位，与C1qrs结合，C1q构象改变，使C1r与C1s裂解C4和C2，大片段C4b和C2a结合成C3转化酶，小片段进入液相。C3转化酶裂解C3,再与大片段C3b结合形成C5转化酶(C4b2a3b)。C5转化酶裂解C5,C5b与C6、C7结合于绵羊红细胞膜上，再与C8结合，再与12-16个C9结合形成MAC(攻膜复合物)。红细胞膜上形成孔道，致死

3、量钙离子内流，绵羊红细胞裂解。补体经典激活途径示意图切Ab亜舍物(IgMIgG)C4aC4b2b3bC5b.6rZS,9|(MAC)细舵裂解补体结合反应实验原理补体结合反应是一种有补体参与，并以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。参与本反应的五种成分可分为两个系统：一为待检系统，即为已知抗原（或抗体）和待检抗体（或抗原）；另一个为指示系统，即绵羊红细胞和其相应的溶血素。待检抗原、抗体和补体作用后，再加入指示系统。若待检系统中的抗原和抗体相对应，两者特异性结合后激活补体，补体被消耗。再加入的指示系统无补体结合,不出现溶血;若待检系统中的抗原与抗体不对应或缺少一方，补体不被激活，当指示系

4、统加入后，绵羊红细胞和溶血素复合物激活补体，产生溶血现象。空斑形成实验是一种体外检测IgM、IgG类型抗体产生细胞的实验方法，又称空斑形成细胞（PFC）测定。可作为评估药物影响抗体产生水平以及临床筛选抗肿瘤新药的重要依据。经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞混合后，抗体形成细胞产生的抗体与绵羊红细胞结合；在补体参与下，绵羊红细胞溶解，形成肉眼可见的溶血空斑。一个空斑即代表一个抗体形成细胞。四、实验过程及步骤实验流程一、SRBC的制备（一）无菌抽取绵羊血1手术剪减去绵羊颈部毛发备皮，止血带扎住颈部，碘酒消毒，酒精棉球再擦拭。2抽取一定量的绵羊血，注入无菌玻璃瓶，轻轻摇晃获得抗凝绵羊血

5、，摇晃时不能用力过猛,防止SRBC破裂。（二）绵羊红细胞的制备1在无菌实验室中，用移液枪吸取5ml抗凝绵羊血于试管中，共4支试管。2配平后对称放入离心机中2000rpm离心10分钟。3.4支试管，胶头滴管吸去上清液，加入适量的灭菌生理盐水后轻轻摇晃混匀。4.再次配平后,2000rpm离心10分钟，2-3次。5吸去上清液，获得绵羊红细胞。（三）绵羊红细胞悬液制备1.20%绵羊红细胞悬液制备在无菌实验室中，用移液枪吸取2ml绵羊红细胞于锥形瓶中，用移液管再加入8ml灭菌生理盐水，混合均匀。2.2%绵羊红细胞悬液制备在无菌实验室中，用移液枪吸取1ml绵羊红细胞于锥形瓶中，量筒量取49ml无菌生理盐水

6、加入锥形瓶，混合均匀。二、溶血素的制备（一）免疫接种程序第|天：家兔多点皮内注射绵羊全血05毫升（2）第天：家兔多点皮内注射绵羊全血1.0毫升第天;家兔多点皮内注射绵羊全血5毫升（4）第天：家兔多点皮内注射绵羊全血Z0毫升第覚天：家免多点皮内注射绵羊全血Z5毫升（6）第理天;家兔耳缘静脉注射20%SRBC10毫升（7）第山天:家兔耳缘静脉注射20%SRBC1.0毫升（二）免疫途径在大白兔背部三个点酒精消毒后，皮下接种绵羊全血。（三）试血1动物免疫18天后缘静脉采血2毫升，离心取血清。2清稀释成不同倍数补体溶血实验。0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0,5mi0.5ml1:100稀释血淸生

7、理盐水1L1沾稀释倍数1ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml1:2001:4001:8001:16001:32001:6400（四）心脏取血胸骨左缘第3、4肋间心脏跳动最明显处。手术剪去毛，消毒后注射器取20ml血。（五）补体灭活与溶血素保存1将心脏血分别注入2支离心管中，各10ml。2配平，2000rpm离心10分钟，保留上清液，即血清。3将血清置于56C恒温水浴锅30分钟，电动移液枪加入等体积甘油，记号笔标明：溶血素、日期、效价（1：6400）。置于-20C冰箱保存。三、补体溶血实验补体结合实验阳性说明待测的Ag（或Ab）与已知的Ab（或Ag）是相对应的。反应系

8、统中形成的Ag-Ab复合物先结合补体，激活的补体被消耗，指示系统中已再无补体参与激活。五、空斑形成实验5KSRBC,D.4ml免疫接种f小鼠；1sdair0.5mlO.Sml（一）免疫小鼠将5%SRBC（0.4ml）注射于小鼠腹腔。（二）脾细胞悬液的制备1免疫5天后，捉取小鼠，固定好。2小鼠腹部消毒后，用镊子提起皮肤，眼科剪剪开暴露腹白线，再剪开肌层暴露腹腔。3用滴管吸取Hank;s液于平皿，用镊子和眼科刀协助取出小鼠脾脏于平皿。4吸取Hanks液于装有脾脏的平皿，镊子夹取200目细胞滤网于离心管口。用眼科剪在脾脏两端剪开小口，再用研磨棒磨碎脾脏（在脾脏两端剪小口便于研磨出小鼠脾细胞，以减轻研

9、磨对小鼠脾细胞的损伤）。5用滴管吸取肝脏研磨液，逐滴滴过200目细胞滤网于离心管，得到脾细胞悬液。配平，1000rpm4C离心5分钟。离心后洗2次，用Hanks液重悬脾细胞，计数调细胞浓度至2X107/mlo（三）底层琼脂板的制备1再酒精灯周围，将加热的1.4%琼脂凝胶倒入平皿中约3ml，待凝胶凝固后倒扣，放入37C恒温培养箱。（四）顶层琼脂板的制备1在45C恒温水浴锅中，在1ml的0.7%琼脂凝胶中依次加入0.5ml5%SRBC悬液、0.5ml107/ml脾细胞悬液、0.5ml1:6补体。2将配比好的顶层琼脂迅速混匀倾注于已铺好底层琼脂的平皿内，静置15分钟，再放入37C恒温培养箱孵育1-1

10、.5ho（五）观察结果五、实验总结一、思考题1为什要对溶血素中的补体进行灭活？便于设置对照，防止实验造成干扰。若未灭活，则不能验证溶血素和补体同时具备才可造成溶血。2补体溶血实验的原理是什么？补体经典激活途径大白兔产生的抗体与绵羊红细胞上抗原表位结合，抗体结构改变，暴露补体结合部位，与Clqrs结合，Clq构象改变，使Clr与Cis裂解C4和C2,大片段C4b和C2a结合成C3转化酶，小片段进入液相。C3转化酶裂解C3,再与大片段C3b结合形成C5转化酶（C4b2a3b）。C5转化酶裂解C5,C5b与C6、C7结合于绵羊红细胞膜上，再与C8结合，再与12-16个C9结合形成MAC（攻膜复合物）

11、。红细胞膜上形成孔道，致死量钙离子内流，绵羊红细胞裂解。3某医生发现药物A具有增强机体抗体产生的能力，请用根据空斑形成实验，设计一个实验方案进行验证。取2只生理状况相近的小鼠，1号小鼠腹腔接种0.4ml5%SRBC+尾静脉注射适量的药物A，2号小鼠腹腔接种0.4ml5%SRBC+尾静脉注射与药物A等量的生理盐水。按照空斑实验步骤，5天后分别取出脾脏，获得脾细胞悬液，制备底层和顶层琼脂板并标记,37C孵育1-1.5h。如果1号小鼠制备的琼脂板相对2号有更多数目的溶血空斑，则药物A具有增强机体抗体产生的能力；若数目相近则药物A没有增强机体抗体产生的能力；若数目减少则药物A具有减弱机体抗体产生的能力

12、。4某医生怀疑患者M可能是梅毒患者，需通过检测其血清中是否含有相应的梅毒抗体。请用补体结合实验的原理设计一个方案进行验证。1补体结合反应实验原理：补体结合反应是一种有补体参与，并以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。参与本反应的五种成分可分为两个系统：一为待检系统，即为已知抗原（或抗体）和待检抗体（或抗原）；另一个为指示系统，即绵羊红细胞和其相应的溶血素。待检抗原、抗体和补体作用后，再加入指示系统。若待检系统中的抗原和抗体相对应，两者特异性结合后激活补体，补体被消耗。再加入的指示系统无补体结合,不出现溶血;若待检系统中的抗原与抗体不对应或缺少一方,补体不被激活，当指示系统加入后，绵羊红细胞和溶血素复合物激活补体，产生溶血现象。2实验设计：n试豔管2L原对;3斗补体对照1&3R9G对鴉1病人血漓025ml0.25hI0.Sul0.35hiIOx25h1o.soJ0.50m10”50怖11C-.50mlQ?5nl0.25nlG5flrlH75n|退甸，37FC3t)rijnQ-5nlQ,25n10.