基因工程复习资料

1、载体载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的DNA分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的DNA片段连接在它的上面，而进行复制.1、载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件克隆载体：克隆一个基因或DNA片断表达载体：用于一个基因的蛋白表达整合载体：把一个基因插入到染色体组中克隆载体的特点作为基因克隆的载体必须具备以下特性：至少有一个复制起点至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞具备多克隆位点（MCS）,便于外源基因插入。自身分子量较小，拷贝数高。在宿主细胞内稳定性高。卩一半乳糖苷酶基因的

2、优点：酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观lacZa编码5-端可容许很大的变化而不影响酶活性lacZa和卩链基因的分别表达可使载体小而容量大质粒载体生物学特性：（1）是染色质外的双链共价闭合环形DNA（少数为线形和RNA）（2）能自主复制，是能独立复制的复制子（3）质粒的生存（4）质粒的不相容性（5）质粒的转移（6）携带特殊的遗传标记质粒载体必须具备的基本条件一种理想的用作克隆载体的质粒必须满足如下几个方面的条件：（i）具有复制起点（ii）具有抗菌素抗生基因（iii）具若干限制酶单一识别位点（iv）具有较小的分子量和较高的拷贝数质粒载体不稳定性的类型结构的不稳定性：主要指由转位和重组作用所

3、引起的质粒DNA的重排与缺失。分离的不稳定性：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒DNA拷贝，并最终增值成为无质粒的优势群体。结构的不稳定性DNA的缺失、插入和重排是造成质粒载体结构不稳定性的原因。1、质粒的自发缺失：同向重复短序列之间的同源重组。2、寄主染色体及质粒载体上的IS因子或转位因子也会引起结构的不稳定性。分离的不稳定性细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配，寄主细胞分裂时一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖为优势群体。要使质粒能够稳定的遗传，必须保证每个世代，每个质粒最少复制一次；细胞分裂过程中，质粒复制的拷贝必须分配到两个子细胞中去。影响质粒载体稳定性的主要因素：1、新陈代谢

4、负荷2、拷贝数差度3、寄主重组体系噬菌体载体噬菌体的一般生物特性可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能：1、保护自己的核苷酸分子(DNA、RNA)免遭环境化学物质的破坏；2、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞；3、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，从而长生出大量的子代噬菌体颗粒；4、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。1入噬菌体的生物学特性是一个温和噬菌体一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周

5、期。溶原保存，并且在一定条件下又可转入溶菌生长途径，进行大量增殖。入噬菌体的特征：1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是转录活性便被一种阻遏物所关闭3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，变成原噬菌体4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制。复制溶源周期随溶源细菌染色体一起复制溶菌周期的早期是“6”复制，晚期进行滚环复制入噬菌体的优点：比一般的质粒载体容量大的多，一般用于真核生物基因组文库的建立M13噬菌体1、单链噬菌体的生物学特性(1)+DNA，是单链闭合环状噬菌体复制型(RF)是双链环状DNA为中间媒介RF

6、DNA和ssDNA都能转染感受态大肠杆菌。并产生噬菌斑。不存在包装限制(噬菌体颗粒大小，是受DNA大小制约)可产生大量的含有外源DNA插入片段的单链分子，便于作探针或测序1.生物学特性寄主M13噬菌体颗粒只感染E.coli的F+细胞外形成丝状DNA提纯，M13DNA(RF)在寄主菌内是高拷贝双链环状分子和游离的单链的正(+)链DNA，象质粒一样自主制复M14的生活周期，虽然不导致溶菌，但使菌斑浑浊没有包装限制3.M13优缺点M13mp载体系列，特别适用于克隆单链的DNA分子。它的优点：第一，在这类载体的基因组中有一条被修饰的0-半乳糖苷酶基因片段，其中插入了一段具有密集的多克隆位点的序列第二，

7、M13载体系列可以有效地克隆双链DNA分子中的每一条单链。M13载体的缺点插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降实际克隆能力小于1500bp。粘粒载体(cosmidvectors)粘粒载体是一类人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体cosmidvector的特点具有入噬菌体的特性提供了体外包装必须的cos位点。所以克隆外源DNA后可以体外包装成入噬菌体颗粒。但是由于cosmidvector不含有入噬菌体溶菌，溶源生长途径和DNA复制系统，所以不会产生子代噬菌体具有质粒载体的特性大多带有pMB1或CO1E的复制子，能像质粒一样复制，具有转化大肠杆菌的功能，还有一些克隆位点

8、。方便的选择：有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点。高容量的克隆能力cosmidcloning应用cosmid载体在大肠杆菌中克隆大片段的真核基因组DNA技术，叫cosmidcloning理论依据：Cos位点：包装识别多联体复制：噬菌体的生命周期中，会产生数百个DNA通过cos位点连接的多联体分子Ter体系：在包装的时候，噬菌体具有位点特异的末端酶(terminase)体系(Ter体系)，识别cos位点，把多联体切成单个DNA长度。包装限制：两个cos位点之间，必须保持38-45kb的DNA，Ter体系才能识别。Cosmid克隆的一般过程用特定的核酸内切酶消化真核生物DNA用同样的内切酶消化

9、cosmid载体连接产物中将有一定比例的分子是两端各有一个cos位点，长度40kb的真核DNA与载体的连接物。Ter体系识别并切割切割合适长度的杂种DNA连接物，并包装入噬菌体头部感染大肠杆菌注入到细菌体内的杂种DNA分子环化，并按质粒的方式复制。Cosmid载体克隆的缺点不如入噬菌体载体。载体片断自我连接外源DNA片断自我连接多个本来不在一起的外源DNA片断连接起来同时插入载体克服载体自体连接的改良方案用碱性磷酸酶除去线性质粒片断5端的磷酸，可防止载体自体连接。细菌的菌落体积远大于噬菌斑，筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于cos质粒制成的基因文库常常

10、不太稳定，插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII的imikdlIIIIIIIIII人工染色体载体人工染色体指人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统人工染色体克隆载体实际上是一种“穿梭”克隆载体，含有质粒克隆载体所必备的第一受体(大肠杆菌)源质粒复制起始位点(ori),含有第二受体(酵母)染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。这样的载体在第一受体细胞内可以按质粒形式进行高拷贝复制。天然染色体基本功能单位包括复制起始点(replicationorigin)、

11、着丝粒(centromere)和端粒(telomere)。复制起始点，保证了染色体复制，着丝粒保证了染色体分离，端粒封闭了染色体末端，防止粘附到其他断裂端，保证了染色体的稳定存在酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)在YAC载体中最常用的是pYAC4。由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状态也是线状的。但是,为了方便制备YAC载体，YAC载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。YAC的特点只能在酵母细胞中扩增克隆容量大，为230kb-1700kb构建原理，按染色体结构构建染色体复制和遗传的三个基本组件YAC

12、载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列(autonomouslyreplicatingsequence，ARS)、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒(centromere,CEN)和两个端粒(TEL)优点可以容纳更长的DNA片段，用较少的克隆就可以包含特定的基因组全部序列，从而保持了基因组特定序列的完整性，有利于物理图谱的制作。缺点克隆外源基因易出现嵌合体。有些克隆不稳定。YAC克隆不容易与酵母自身染色体相分离。表达载体该类载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的，主要增添了强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。表达载体(Expres

13、sionvectors)就是在克隆载体基本骨架的基表达载体必备元件表达载体除了要具有克隆载体的基本元件(ori,Ampr,Mcs等)还具有转录/翻译所必需的强启动子、一：_核糖体结合位点、始mRNA合成的序列。因扩增，还能使其表达。第一必须是强启动子,能够克隆基因的蛋第二、应能呈现低水平的基础转录，转录起始信号、转录终止子、1羽译起始密码子终止密码子等础上增加表达元件，是目的基因能够表达启动子子：是DNA上的能与RNA聚合酶结合圭启动子具备的条件学试剂来诱导表达。(IPTG)质产物的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质，使2的启动子是一种极为用咼第

14、三应是诱导型的,，用温鸟乳糖启动子Plac的可控性：野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高2.翻译的起始位点核糖体结合位点(RBS)ribosomebindingsiteShine-Dalgarno(SD)sequence起始密码子，位于SD下游转录终止子：源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。翻译终止子：大肠杆菌偏爱使用终止子UAAU,般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃翻译增强子：显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率。原核表达载体非融合型表达载体载体表达出的外源基因蛋白不与细菌的任何蛋白质融合在一起。优点：产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。rrnB:终止子tac:启动子Ampr:氨苄抗性基因Tetr:四环素抗性基因pBR322:来源于pBR322载体的基因S-D:插