总RNA提取-常用方案

1、-. z.试剂盒快速提取实验方法原理GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用，将促使核蛋白复合体的解离，使RNA 与蛋白质别离，并将RNA 释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA ，则根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法进展，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA 进入水相，这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA别离。水相中的RNA 可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA 沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进展二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA 中如含无机盐，则有可能对以后操作中的一些酶促反响产生抑制。实验材料微生物

2、动物细胞植物组织试剂、试剂盒RNA 提取试剂盒焦碳酸二乙酯乙醇仪器、耗材恒温水浴冷冻高速离心机紫外分光光度计取液器电泳仪电泳槽实验步骤一、细胞或组织破碎1. 微生物材料1发酵34天或对数生长期的菌体，离心收集菌丝体动植物材料无需此步处理。2用经DEPC处理的水洗菌丝体23次，并尽量除去残存的水。3加液氮充分研磨，使其成为粉末，以释放RNA。4研磨后的样品转移至12 ml变性液的容器中匀浆。2. 动植物细胞培养材料适用的样品量为细胞：1081细胞或组织培养：按常规方法进展。2深层悬浮培养细胞的破碎。细胞收集：含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中，4，3 000 g 离心5分钟。细胞洗涤：上步沉

3、淀用25 ml 灭菌后冰冻的1PBS缓冲液洗涤，然后4，3 000 g 离心5分钟。细胞破碎：在沉淀细胞中参加15 ml 预冷的变性液，用无菌处理过的匀浆器匀浆。3. 外表培养细胞的破碎1确定培养瓶数量，使选定的各培养瓶细胞累加后总量达108。2细胞收集：将培养液倒掉，用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤一次，在培养瓶中参加8 ml 预冷变性液。3转动培养瓶，使细胞溶解，此时可见粘度加大。4用无菌吸管将第一个培养瓶中的液体吸入第二个培养瓶，旋转，溶解细胞，再吸入第三个培养瓶，以此类推。5直到将所选定的培养瓶全部洗涤一次，然后从第一个培养瓶开场再参加4毫升上述变性液，将所有培养瓶洗一次。6将上述12 m

4、l 含细胞的变性液转移至一50 ml 无菌离心管中，匀浆破碎细胞。4. 植物组织破碎适用的样品量为0.05 g 组织1将600 ul 变性液置于1.5 ml 离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。2将0.05 g 新鲜组织用液氮冰冻。3在液氮下，研磨组织块。4待液氮挥发后，将上述分散的组织转移至无菌离心管中。5. 动物组织破碎适用的样品量为1 g 组织1将12ml 变性液置于50ml 离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。2在上述管中参加1 g 新鲜或冰冻动物组织，匀浆粉碎。二、RNA 的抽提1. 在经变性液匀浆的细胞或组织600 ul+60 ul pH4.0的2 M 乙酸钠彻底混匀，可用漩涡

5、振荡器。2. 600 ul 酚氯仿异戊醇25241，彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。3. 冰裕中1015分钟，离心，4，10 000 g，20分钟。4. 上层水相吸至无菌离心管中加等体积的异丙醇，-70，30分钟沉淀RNA。5. 离心4，10 000 g，20分钟。6. 沉淀RNA ，冷冻枯燥15分钟， RNA 沉淀重新溶于300 ul 变性液中，可振荡有时为了帮助溶解，可在65加热，但时间应极短。7. 60 ul pH4.0的2 M 乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器。8. 600 ul 酚氯仿异戊醇25241，彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。9. 冰裕中1015分钟，离心，4，10 000 g

6、，20分钟。10. 上层水相吸至无菌离心管中。11. 等体积异丙醇二次沉淀-70，30分钟，75%乙醇洗沉淀，沉淀冷冻枯燥。12. 复溶于去RNA 酶的水中对于准备长期保存的RNA 可参加pH 5.0的乙酸钠至终浓度为0.25 M，再参加2.5体积的乙醇，-70保存。展开考前须知1. 研磨组织块用于RNA 提取的样品，必须是新鲜的细胞或组织，如采样后，不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70的冰箱中保存。2. 变性液及相应的离心管需预冷。其他1. 变性液组成25 g异硫氰酸胍溶于33 ml CSB(42 mM pH4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2 mM -巯基乙醇)，65

7、溶解，过滤灭菌，4预冷。2. 酸性酚配制55时，500 g酚溶入500 ml 50 mM，pH4.0乙酸钠，混匀，静止分层后，去上清，再反复加500 ml 50 mM，pH4.0乙酸钠，直到pH4.1。氯化锂提取法实验方法原理用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA 酶，用氯化锂选择沉淀RNA ，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA ，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA 得率不高，小RNA 片断丧失的缺陷。实验材料微生物动物细胞植物组织试剂、试剂盒氯化锂尿素Tris-HCLEDTASDS仪器、耗材恒温水浴冷冻高速离心机紫外分光光度计取液器电泳仪电泳槽实验步骤一、组织或细胞匀浆1

8、. 对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞参加510 ml 氯化锂-尿素溶液，匀浆器高速匀浆2分钟。2. 对于少量细胞107个细胞/ml，则每克组织或细胞参加0.5 ml 氯化锂尿素溶液手工匀浆，并转移至Eppendof管中。二、纯化1. 匀桨液在04放置4小时后，12 000 g 离心30分钟。2. 取沉淀，参加原匀桨液1/2体积的氯化锂尿素溶液，重复步骤1。3. 沉淀用原匀浆液1/2体积的氯化锂尿素溶液复溶后，参加等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置1530分钟并不时摇动混匀，4 000 g 离心5分钟。4. 取上层水相，加1/10倍体积的3 M 乙酸钠pH5.2及2倍体积的乙醇，-20放置1小

9、时，5 000 g 离心。5. 70%乙醇洗沉淀一次，真空枯燥。6. RNA 溶解液溶解沉淀，得RNA 。三、保存分装，于-70保存。一步法实验材料RNA试剂、试剂盒乙酸钠氯仿异戊醇异丙醇乙醇SDS酚仪器、耗材离心机分光光度计摇床实验步骤1. 组织来源材料：100 ng 组织加1 l 变性液，在玻璃Teflon匀浆器中将其匀浆。2. 培养细胞：离心弃悬浮细胞培养液或倒去单层培养细胞培养液不需用生理盐水洗涤，每107细胞参加1 ml 变性液，然后用吸管抽吸710次。3. 将匀浆移入5 ml 聚丙烯管子，参加0.1体积的2 mol/l pH4.0的乙酸钠缓冲液，混匀。4. 参加1 ml 水饱和酚，

10、混匀；再参加0.2体积的49：1氯仿/异戊醇。5. 混匀后0 4放置15 min。6. 于4用SS-34转子10 000 g 离心20 min，将上层水相移入一个干净试管中。7. 参加1 ml 等体积异丙醇-20放置30 min 沉淀RNA，于4 10 000 g 离心10 min。8. 将RNA溶解于0.3 ml 变性液，并移入1. 5 ml 微量离心管中，加0.3 ml 异丙醇,。9. -20放置30 min 沉淀，于4 10 000 g 离心10 min。10. 重悬RNA沉淀于75%乙醇，旋起沉淀，室温放置1015 min，10 000 g 离心5 min。11. 真空枯燥RNA 51

11、0 min，溶解沉淀于100200 l DECP此处理过的水或DEPC处理过的0.5%SDS，-70冰冻保存或保存在-20的乙醇中。CsCl法实验材料RNA试剂、试剂盒PBS异硫氰酸胍CsClDEPC无水乙醇仪器、耗材注射器电泳仪离心机培养箱实验步骤一、用于单层培养细胞1. 室温下用PBS冼涤细胞，每平皿用5 ml，洗2次。2. 在不超过108细胞中参加异硫氰酸胍溶液，并使之遍布整个平皿。3. 用橡皮细胞刮子擦刮平皿，回收粘稠的细胞裂解液。4. 用装有20-G针头的皮下注射器往返抽吸裂解物，并合并在一起。二、用于悬浮培养细胞1. 用JS-4，2转子离心回收108细胞，重悬于相当于1/2原有体积

12、的PBS，并再次离心回收细胞。2. 往离心管中参加3.5 ml 异硫氰酸胍溶液。3. 用装有20-G针头的6注射器将粘稠的细胞裂解液注返抽吸4次，并将其移至一个干净的试管中。4. 在经硅化并高压过的13 mm51 mm 的异质同晶聚合物超离心管中，参加1. 5 ml 5.7mol/l CsCl。5. 并在此垫层上参加3.5 ml 细胞裂解液，界面应清晰。6. 于18用Beckman SW-55转子150 000 g 离心1220 h缓慢加速和减速。7. 用巴斯德吸管的管尖在液面上吸取上清，管子随液面的下降而下降。8. 当吸至仅剩约100 l 时，小心倒置管子，倒出剩余液体。9. 晾干沉淀约510 min，然后以360 l TES溶液重溶沉淀，反复地以吸管上下抽吸。10. 如此在室温进展510 min，转移溶液于另一干净的微量离