科研立项项目申报书-β-胡萝卜素提取

1、XXXX大学生科研项目申报书项目名称：B-胡萝卜素的提取申请者：XXX申报时间：2009年8月10日项目类别：A类（，） B类（）共青团苏州科技学院委员会申请简况表说明：1、必须由申报者本人按要求填写。2、院（系）推荐意见签章视为对申报者情况的确认项目名称B-胡萝卜素的提取所属科类理科申请人姓名xxx性别女出月1989 年07月院（系）化学与生物工程学院专业生物技术年级二年级联系合作者姓名性别年龄学历单位备注本科在读苏州科技大学()无院 系 认 证是否为我校正式注册在校的学生（专科生、本科生）。（，）是（）否本课题是否为学生课外学术科技作品。（，）是（）否其它：签章：年 月日目前，全球B -胡

2、萝卜素的生产量约为600t/a ,年需求量为 12001500 t,且每年以7%9%速度增长。美国的需求量近些 年以10%15的速度递增。且在欧美和日本等国已形成市场。 2000年中国（3-胡萝卜素的生产量为10 t ,其中40卿于出口。 2001年我国B-胡萝卜素的生产能力为22 t,国内B-胡萝卜素 的总消费量的的70湘于食品工业，其次用于保健品和医药行业 1。因（3 -胡萝卜素可用作食品添加剂，饲料添加剂和化妆品助 剂，且（3-胡萝卜素在防治癌症和心血管疾病方面有特殊的作 用，所以，（3-胡萝卜素越来越引起人们的关注和兴趣。目前， 市场上有多种B-胡萝卜素的生产方法：化学合成法：化学合成

3、法是指采用有机化工原料，通过化 学合成反应，人工合成B-胡萝卜素的一种方法。项 目 主 要 内 容提取法：即从胡萝卜、枸杞、马铃薯、玉米等天然植物原 料中直接提取B-胡萝卜素的一种方法。生物合成法：生物合成法是指利用微生物培养技术，通过 微生物的培养，利用微生物在其体内合成 B-胡萝卜素，然后自 微生物体内分离得到B-胡萝卜素的一种方法。利用三胞布拉氏 霉菌生产B-胡萝卜素就是生物合成法的一种。研究表明，采用三胞布拉氏霉菌发酵生产胡萝卜素不仅因 其胡萝卜素合成水平极大高于多种生物体，而且B -胡萝卜素含量在85%Z上，其结构与标准的（3-胡萝卜素相同；而且具有生 产原料易获得，不受自然条件限制

4、，周期短和适用于工业化生 产等优点。可以确认三胞布拉氏霉菌是目前应用于工业生产胡 萝卜素最重要的菌株。下面就目前状况对其理化性状，生理功能以及利用三抱布拉 氏霉菌生产B-胡萝卜素的方法做一介绍。1 B-胡萝卜素的理化性状B-胡萝卜素，分子式为 C40H56分子量为536.88。深红紫至 暗红色有光泽的斜面6面体或板状微结晶的晶体或结晶性粉末。有轻微异臭或异味。稀溶液呈橙黄色至黄色，浓度增大时带橙 色因溶液的极性可稍带红色。遇氧、热、光不稳定，在弱碱下 较稳定。不溶于水、丙二醇、甘油、酸和碱；溶于二硫化碳、2苯、氯仿、己烷及植物油；几乎不溶于甲醇和乙醇。在人体 和动物的肠黏膜及肝脏中，1分子的（

5、3 -胡萝卜素在15=15碳原 子位置，通过加氧酶的催化作用下，分裂为2分子的视黄醛，经过还原过程，形成2分子的视黄醛，经过还原过程，形成 2 分子的视黄醇（VQ。3 B -胡萝卜素的生物提取技术材料与方法菌种与培养基菌种：三胞布拉氏霉菌JM9203（正株）、JM9204（负 株）。培养基：项 目 主 要 内 容PDA斜面培养基：15麻鲜去皮马铃薯;2%萄糖；2演脂， PH自然。分装试管后，0.1Mpa灭菌20min,斜面表面水干后使 用。液体种子培养基：淀粉 4%葡萄糖 2%玉米浆5% KHPO0.1%; MgSQ.01%; VB1mg/100ml;消前 PH6.7,装量为 40ml/250

6、ml三角瓶，0.1Mpa灭菌20分钟。摇瓶发酵培养基：淀粉 4%黄豆饼粉4%玉米浆3% KHPO0.1%; MgS（0.01%;盐酸硫胺素 10mg/L;灭菌前调 PH7.7, 装量为50ml/500ml三角瓶，0.1Mpa灭菌40分钟。补料：在发酵48h左右添加0.1% （3 -紫罗兰酮及适量无菌 水。方法碳、氮源实验：在种子培养基或摇瓶发酵培养基中 改变碳、氮用量比。装量为40ml/250ml三角瓶，每组设三个重 复，0.1Mpa灭菌40分钟。“+、-”菌株按5: 5的比例总量10% 接种，于280c 200rpm振荡培养。培养48h,无菌操作补加0.1% B-紫罗兰酮。培养至120h终止

7、。培养基正交实验：在单因素试验后，确定了培养基 中的四种因素及三个水平按 L排列组合。装量为50ml/500ml三 角瓶，三个重复。（3 -胡萝卜素的测定方法：离心收集发酵液中的菌丝体， 5055oC真空干燥、研磨。有机溶剂提取菌体中的色素14。采用 紫外分光光度计测定最高吸收峰的吸光值，参照方法15测定并计算B-胡萝卜素的含量。菌种试验：除种子培养基碳源试验外，菌种不同性 别发酵试验以及种龄试验均按常规方法进行。生物量测定：准确量取发酵液，用双层纱布过滤， 自来水反复冲洗、拧干、撕成碎片置于平面皿内，5055oC抽真 空干燥，用1/100g精确度天平称量。试验结果表明，以4帆碳源较为适宜，生

8、物量和（3-胡萝卜 素的生产水平都较高。虽然在4瘫粉的基础上再添加1滞萄糖 总色素水平有所提高，但是（3-胡萝卜素未增加，因而无实际意 义。而且用葡萄糖为种子培养基的碳源培养基质粘性差，不利 于菌丝体伸张，易形成较大的团块，这样可能造成种子菌体被 接入发酵培养基后营养物质的利用不充分。培养基中的氮源对（3-胡萝卜素的影响由于试验所采用的氮源均为农、副产品，其营养成分与含 量差异较大，因而不同的氮源物质对B-胡萝卜素合成水平有很 大的影响。以棉籽仁和黄豆饼粉为主要氮源所组成培养基较为 适宜，而玉米浆与棉籽仁或黄豆饼粉混合使用更有利于提高生 物量和B-胡萝卜素的生产水平。培养基正交试验在碳、氮物质

9、因素试验后，拟定淀粉、黄豆饼粉、玉米浆 以及植物油为影响三胞布拉氏霉菌合成B-胡萝卜素水平的主要因素设计正交实验。实验表明，培养基组合3无论其生物量还是胡萝卜素水平均高于其它组合，因其碳、氮以及植物油配 较佳所致。影响胡萝卜素合成水平的主要因素依次为植物油、 淀粉，影响影响较小的应为黄豆饼粉。3.2.2菌种试验结果菌株的性别：三抱布拉氏霉菌有雄性（+）和雌性 （-）菌株，在相同条件下，单独发酵“ +”和“-”株，其类胡 萝卜素合成水平分别为36.6mg和263.7mg/L发酵液，而当“ +” “-菌株混合发酵时，其胡萝卜素合成水平达1113mg/L发酵液，这是因“ +”和“-”株混合培养有利于

10、产生促进胡萝卜素 的三胞酸所起的作用。菌种培养时间：分别采用培养 24、32、40、44和 48h的液体菌种发酵试验结果表明，培养 3248h的菌种均可用于发酵，但培养4044h的菌种更有利于胡萝卜素的合成。在实验室条件下，通过对三胞布拉氏霉菌合成（3 -胡萝卜素、菌种培养基摇瓶发酵比较实验，以生物量（每升发酵液中 菌丝体干重）、类胡萝卜素和（3-胡萝卜素合成水平为结果标准， 筛选出适用于发酵三胞布拉氏霉菌培养基的碳、氮源物质和配 比。同时对植物油的选择与用量、中间添加（3-紫罗兰酮也进行 了实验，证明这些物质均不同程度的影响着三胞布拉氏霉菌合 成B -胡萝卜素水平，为深入研究三胞布拉氏霉菌的

11、发酵与B -胡萝卜素产品研制奠定了基础16。项 目 主 要 内 容经湖北省卫生防疫站食品卫生检测所检测，急性毒性试验 所得结果送检样品属实无毒级；小鼠精子畸变试验，实验组与 阴性对照结果无显著差异，表明该受试物的精子畸变实验为阴 性；小鼠骨髓嗜多染色红细胞微核试验，实验组与对照组的结 果无显著差异，表明该受试物的微核实验为阴性。因此证明， 利用三胞布拉氏霉菌发酵生产出来的 B-胡萝卜素无污染、无毒 害，可用于大规模的工业生产17。结束语B-胡萝卜素易于氧化，所以不管采用何种设备方法，都必 须防止生产过程中B-胡萝卜素不必要的损失。针对目前 B-胡 萝卜素供不应求的状况，探索出一种成本低、产率高

12、、无污染、 无毒害、适于大规模工业生产的制备B-胡萝卜素的方法非常必 要。B-胡萝卜素在医药、食品、及保健领域有着很好的应用市场，特别是近年来，随着癌症发病率的升高，B-胡萝卜素因其有着 特异的功效，所以近年来一直是市场上供不应求的紧俏商品。所以深入对其的认识，大力开发B-胡萝卜素的产业，将推动食 品、医药、饲料、化妆品行业的发展，具有很好的市场前景。项 目 的 价 值 和 意 义B-胡萝卜素是维生素A的重要来源由上述的B-胡萝卜素的理化性状可知，1分子的B-胡萝卜 素在体内酶的作用下可转变为2分子的维生素A,且在食物中含 量最丰富，因而被认定是人体内维生素 A的主要来源。通过实 验发现2,缺

13、乏维生素A的大鼠补饲（3-胡萝卜素后能显著提高 体内维生素A的水平，从而证实了 B -胡萝卜素能在体内酶的作 用下转化为维生素A,发挥2t生素A的作用，所以又称维生素A 源原。该转化酶在体内维 A缺乏时将（3-胡萝卜素转化为维A, 当体内维A增加到需求量时，酶即停止转化，从而通过酶的自 动控制来维持体内维 A的的需要。全世界，特别是发展中国家 人体所需的维A60%70%源于（3 -胡萝卜素。维A是合成糖蛋白的载体，糖蛋白是细胞的重要结构物质， 尤其是上皮细胞，如果缺少糖蛋白将对眼，呼吸道，皮肤，消 化道，泌尿道及生殖器官产生影响。免疫球蛋白也是一种糖蛋 白，维A缺乏将会影响抗体的形成。因此，维

14、 A对保证正常的 生长和发育及抗感染具有重要的作用。但是，人体摄入大量的维A,会引起急性及慢性中毒主要是 骨痛，皮肤黏膜改变，颅内压升高等。而（3-胡萝卜素本身无毒 性，当摄入大量的（3-胡萝卜素时体内产生积蓄，但不会引起中 毒3。因此，无论是治疗维 A缺乏症还是防止癌症，使用（3-胡 萝卜素都更好，更安全。2.2 （3 -胡萝卜素是具有抗氧化作用人体在正常的生理代谢过程中会产生少量的含氧自由基， 而体内的防御机制（抗氧化酶或抗氧化剂）会及时将其清除， 以维持氧自由基的代谢平衡。因此一般不会对细胞，组织产生 损伤。但随着年龄的增长或在某些病理状态下，体内抗氧化酶 的作用下降，过多的氧自由基不能

15、被及时清除而堆积在细胞内， 导致它们迅速与机体内的一些生物大分子，如蛋白质、核酸氨 基酸、脂类等发生反应，生成氧化物或过氧化物。这些物质会 对细胞产生毒性，使细胞膜、组织、酶以及基因受损，从而引 起机体多种疾病的发生和衰老。B-胡萝卜素的抗氧化作用是基于它分子中的多个共钝多 烯双键的特殊结构，这种结构使它能与含氧自由基发生不可逆 反应，生成非常稳定的以碳为中心的自由基 B-car .,这个碳项 目 的 价 值 和 意 义核自由基可以迅速可逆的与氧反应生成一种新的带链的过氧化 自由基B-car-OO .。但这个可逆反应的速率受氧分压的影响非 常大，当氧分压降低时，反应就会充分的向碳核自由基的方向

16、 进行，这样就有效的降低了体内过氧化自由基的浓度，并能及 时阻止自由基的链式反应，因此也减少了体内脂质过氧化的数 量。由此可知（3-胡萝卜素是一种有效的抗氧化剂，类萝卜素也 因可以清除自由基以及淬灭单线态氧的活性受到了普遍关注。 日益增加的研究表明与衰老的过程相关联的多种缺陷是细胞内 的多点位氧化损伤积累的直接后果。例如：心血管疾病的发病 机理之一是低密度脂蛋白的氧化损伤而导致的；一些光化学对 晶体所造成的损伤的会导致白内障的形成等。而（3-胡萝卜素的高效抗氧化性能使活性氧变为稳定的氧分子。荷兰的一项研究 表明，具有摄取含B-胡萝卜素这种健康饮食习惯的老人，发生 心力衰竭的危险性较低。现已知1

17、分子（3 -胡萝卜素可抑制1000 个分子的活性氧4,同时还可以作为一种弱氧化剂直接与自由基 反应，阻止自由基的连锁反应，从而减少它对细胞的损伤。在 探讨抗氧化营养对 DNA氧化损伤保护作用时，经研究发现连续 服用（3-胡萝卜素、维生素E和维生素C,可显著降低由过氧化 氢诱发DNA勺损伤。2.3 （3 -胡萝卜素可以促进细胞缝隙间连接 交流B-胡萝卜素细胞间形成的间隙连接使细胞质相互沟通，通 过交换小分子来调节代谢反应。间隙连接的基本单位是连接子， 每个连接子由2个相同或相似的跨膜蛋白压单位环绕，中心形 成一个直径约1.5nm的孔道，相邻细胞质膜上的两个连接子相 对便形成一个间隙单位。它允许小

18、的代谢物、细胞内信息及离 子自由出入，但蛋白质、mRN屋大分子则被排除在外，以保持 各细胞的遗传一致性。Bertram等发现（3-胡萝卜素和其它类胡 萝卜素可以加强细胞间隙连接的交流能力，从而抑制或降低癌 症的发生或发展；Yamasaki也指出构成细胞连接通道的连接蛋 白，在转化阶段的癌细胞会由于通道的受阻而干扰细胞的交换， 这种交换是控制生长的因素之一，从而抑制癌症诱导细胞升级 到恶化阶段6。国内外进行了大量的关于B-胡萝卜素的抗肿瘤机制的研究,认为B-胡萝卜素抗癌机理有以下几种：转化为视黄醇（VA项 目 的 价 值 和 意 义而起作用、抗氧化机制，提高机体免疫力等7.8。多种研究2亦 证实

19、B-胡萝卜素是细胞间通讯的诱导剂，它能增强转化癌起始 细胞与健康细胞的交流作用，而且目前研究人员通过荧光燃料 示踪技术已获得B -胡萝卜素增强转化细胞和末转化细胞间的 GJIC功能的直接证据，但对于其具体的调节机理尚不清楚。（3 -胡萝卜素的可以增强免疫力，提高人体免疫系统抵抗致 癌物的能力免疫系统的两个主要功能是抵御细菌或病毒的侵染和防止 癌症的发生。类胡萝卜素在增强人体的免疫能力方面具有明显 的作用。类胡萝卜素能增加免疫系统中 B细胞的活力，B细胞能 在体内循环，从而消灭外源入侵的病原体；类胡萝卜素能提高 淋巴辅助T细胞（CD4的活力，能协助B细胞产生抗体，并能 提高其它免疫组分的活性；类

20、胡萝卜素能增加嗜中性白血球的 数目，它可以包围细菌，并分泌包围细菌的酶；类胡萝卜素能 增加自然杀伤细胞（NK的数目，以消除机体内被感染的细胞 或癌细胞。目前，已经有很多关于服用类胡萝卜素对免疫活性 的影响的报道。流行病学的研究结果表明9,高剂量的（3-胡萝卜素的摄入 与肺癌、胃癌、食道癌、前列腺癌的发生率间存在着明显的负 相关；与肠癌的发生率存在着中度的负相关；而与乳腺癌、膀 胱癌、子宫颈癌、子宫内膜癌的发生率间的相关性不明显或存 在着正相关。吃富含（3 -胡萝卜素的食物可增强生物机体的特异 性及非特异性免疫功能。目前，称B-胡萝卜素为肿瘤的化学防预剂，它消除氧自由 基、控制自由基的生成、促进巨噬细胞释放肿瘤坏死因子（TNF 和干扰素（IFN）、促进免疫细胞的增殖，