蛋白质化学蛋白质结构和功能关系

1、关于蛋白质化学蛋白质结构与功能的关系第一张，PPT共七十六页，创作于2022年6月第二章 蛋白质protein第二张，PPT共七十六页，创作于2022年6月第五节蛋白质结构与功能的关系（The Relation of Structure and Function of Protein）第三张，PPT共七十六页，创作于2022年6月（一）一级结构是空间构象的基础 一、蛋白质一级结构与功能的关系 牛胰核糖核酸酶的一级结构二硫键第四张，PPT共七十六页，创作于2022年6月 天然状态，有催化活性 尿素、 -巯基乙醇 去除尿素、-巯基乙醇非折叠状态，无活性第五张，PPT共七十六页，创作于2022年6月

2、多肽链中氨基酸的排列顺序决定了肽链的折叠和卷曲方式部分氨基酸残基在蛋白质空间结构中处于关键位置第六张，PPT共七十六页，创作于2022年6月1、种属差异同源蛋白（homologous protein) 在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质。同源蛋白质的氨基酸顺序具有明显的相似性即为序列同源。 （二）一级结构与功能的关系 第七张，PPT共七十六页，创作于2022年6月如不同哺乳动物的胰岛素分子结构都由A和B两条链组成，且二硫键的配对和空间构象极其相似。一级结构也相似，仅有个别氨基酸有差异，因此它们都执行着相同的调节糖代谢的生理功能。同源蛋白的一级结构中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同

3、的，称为不变残基（invariant residue） 。其他位置的氨基酸差异较大，称为可变残基（variable residue） 。第八张，PPT共七十六页，创作于2022年6月哺乳动物胰岛素氨基酸序列差异胰岛素人猪狗兔牛羊马 氨基酸残基序列号A5ThrThrThrThrAlaAlaThrA6Ser SerSerGlyGlySerSerA10 Ile Ile Ile IleValValIleB30ThrAlaAlaSerAlaAlaAla第九张，PPT共七十六页，创作于2022年6月 是一种与血红素辅基共价结合的单链蛋白，存在于真核生物线粒体中。相对分子量约为13,000，含有104个氨基

4、酸残基。近100个种属的细胞色素c氨基酸顺序已被测定。肽链中28个位置的氨基酸对所有已测试的种属都相同的，表明，这些残基是规定细胞色素c功能所必需的。细胞色素c（cytochrome c, Cyt.c）第十张，PPT共七十六页，创作于2022年6月生物名称与人不同的氨基酸参加数目生物名称与人不同的氨基酸参加数目黑猩猩0响尾蛇14恒河猴1海龟15兔9金枪鱼21袋鼠10角鲛23牛、猪、羊10小蝇25狗11蛾31驴11小麦35马12粗糙链孢菌43鸡、火鸡13酵母菌44不同生物与人细胞色素c的氨基酸数目比较第十一张，PPT共七十六页，创作于2022年6月 狗人猴 马骡 鲸 兔猪袋鼠企鹅鸡 鸭响尾蛇龟苍

5、蝇 蛾脉孢菌属念珠菌属面包酵母菌小麦牛 蛙金枪鱼动 物爬行动物两栖动物鱼哺乳动物鸟昆 虫植 物脊椎动物从细胞色素C的一级结构看生物进化生物进化第十二张，PPT共七十六页，创作于2022年6月2、一级结构改变引起分子病 例：镰刀形红细胞贫血N-val his leu thr pro glu glu C(146) HbS 肽链HbA 肽 链N-val his leu thr pro val glu C(146) 基因突变导致蛋白质一级结构的突变，导致蛋白质生物功能的下降或丧失，这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病（molecular disease）” 。第十三张，PPT共七十六页，

6、创作于2022年6月 最早从分子水平证明的先天性遗传病镰刀形红细胞贫血症(sickle-cell anemia)。镰刀形红细胞正常血细胞hemoglobin 6: GAA(Glu) - GTA(Val) 第十四张，PPT共七十六页，创作于2022年6月血红蛋白 -链上谷氨酸变成缬氨酸镰刀状贫血病 的分子机理第十五张，PPT共七十六页，创作于2022年6月3、蛋白质前体的激活 一些蛋白质或酶在细胞中首先合成的是其前体,在成为有功能的蛋白质或酶之前需要激活. 例如,胰岛素(insulin ).的前体是胰岛素原(proinsulin),要在切除C肽之后才转变为活性的胰岛素胰岛素原的一级结构第十六张，

7、PPT共七十六页，创作于2022年6月一级结构差异越小，功能相关性越大。一级结构上的细微变化可直接影响其功能第十七张，PPT共七十六页，创作于2022年6月（一）血红蛋白与肌红蛋白的结构 二、蛋白质空间结构与功能的关系 第十八张，PPT共七十六页，创作于2022年6月1、血红素 肌红蛋白(myoglobin,Mb)与血红蛋白都是含有血红素辅基的蛋白质。血红素是铁卟啉化合物，由4个甲炔基相连成为一个环形，Fe2+居于环中。铁离子有6个配位键，其中4个与吡咯环的N配位结合，1个配位键和肌红蛋白的93位组氨酸残基结合，氧则与Fe2+ 形成第6个配位键，接近第64位（E7)组氨酸。第十九张，PPT共七

8、十六页，创作于2022年6月肌红蛋白（myoglobin, Mb） 肌红蛋白是一个只有三级结构的蛋白质，有8段-螺旋结构，分别成为A B C D E F G H肽段。整条多肽链折叠成紧密球状分子，氨基酸残基上的疏水侧链大都在分子内部，富极性及电荷的则在分子表面，因此水溶性较好。Mb分子内部有个袋形空穴，血红素居于其中。第二十张，PPT共七十六页，创作于2022年6月血红蛋白（hemoglobin, Hb） 血红蛋白具有四个亚基组成的四级结构，每个亚基中间有一个疏水局部，可携带一个血红素并携带一分子氧，因此1分子Hb共结合四分子氧。Hb各亚基的三级结构与Mb极为相似。Hb亚基之间通过八对盐键，使

9、四个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。第二十一张，PPT共七十六页，创作于2022年6月Hb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。2、血红蛋白的构象变化与结合氧 第二十二张，PPT共七十六页，创作于2022年6月* 协同效应(cooperativity) 一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应 (positive cooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应 (negative cooperativ

10、ity)第二十三张，PPT共七十六页，创作于2022年6月抗体生物体内最奇妙的分子无限的多样性（diversity)功能与结构的双重性 可变区抗原结合 恒定区生物学效应功能（二）免疫球蛋白的结构与功能第二十四张，PPT共七十六页，创作于2022年6月（1）抗体的基本结构Ig分子基本结构是由四个肽链组成的。包括二条较小的轻链和二条较大的重链。轻链与重链之间是由二硫键连接形成Ig分子单体。 第二十五张，PPT共七十六页，创作于2022年6月（1）抗体的基本结构第二十六张，PPT共七十六页，创作于2022年6月（2）可变区和恒定区可变区和抗原识别有关，决定抗体识别的特异性，而恒定区和效应功能相关。此

11、外在Y形分子伸出的两臂和主干之间还有个可弯曲的铰链区(hinge R)，能改变两个结合抗原的Y形臂之间的距离。两臂之间的角度可有自0到90的变化，这样有利于两臂同时结合位于抗原上分布于不同位置的表位。第二十七张，PPT共七十六页，创作于2022年6月铰链区第二十八张，PPT共七十六页，创作于2022年6月Ig的铰链区及其功能第二十九张，PPT共七十六页，创作于2022年6月（三）蛋白质构象改变与疾病 蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。第三十张，PPT共七十六页，创作于2022年6月蛋白质构象改变导致疾病的机

12、理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。第三十一张，PPT共七十六页，创作于2022年6月疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。PrPc-螺旋PrPsc-折叠正常疯牛病第三十二张，PPT共七十六页，创作于2022年6月第六节蛋白质的性质与分离、分析技术第

13、三十三张，PPT共七十六页，创作于2022年6月一、蛋白质的性质相对分子质量很大，一般介于10 000-1 000 000道尔顿之间，也有更大的。测定分子量的方法很多：渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。（一）蛋白质相对分子质量第三十四张，PPT共七十六页，创作于2022年6月（二）蛋白质的两性性质及等电点蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零

14、，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。第三十五张，PPT共七十六页，创作于2022年6月 各种蛋白质有特定的等电点，和它所含的氨基酸种类和数量有关。 例：含有碱性氨基酸较多，则pI偏碱（偏大） 含有酸性氨基酸较多，则pI偏酸（偏小）； 含有酸、碱氨基酸数目相近时，pI为中性偏酸，约为5.0左右。 pHpI，蛋白质带负电，体内蛋白质的pI大多为5.0左右，故生理条件下一般以负离子形式存在。 第三十六张，PPT共七十六页，创作于2022年6月蛋白质 酸性氨基酸数 碱性氨基酸数 pI胃蛋白酶 37 6 1.0胰岛素 4 4 5.35RNA酶 10 18 7.8细胞色素c 12 25 9.810.8等电

15、点时，蛋白质以两性离子存在，最不稳定，溶解度最小，易沉淀析出（用于蛋白质的分离提纯）；蛋白质的粘度、渗透压、膨胀性以及导电能力均最小。第三十七张，PPT共七十六页，创作于2022年6月（三）蛋白质的变性与复性 * 蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏（即有序的空间结构变成无序的空间结构），从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。第三十八张，PPT共七十六页，创作于2022年6月造成变性的因素物理因素：加热、紫外线、X线、超声波化学因素：乙醇等有机溶剂、强酸、强 碱、重金属离子及生物碱试剂等 。 变性的本质 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质

16、的一级结构。第三十九张，PPT共七十六页，创作于2022年6月变性特征： 生物活性丧失； 理化性质改变：溶解度降低、球状蛋白质的不对称性增加、粘度增加、扩散系数降低，某些蛋白质不能够再形成结晶, 变性后分子结构松散、易被水解，变性蛋白易被酶消化。 组成和相对分子质量不变第四十张，PPT共七十六页，创作于2022年6月若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。蛋白质的复性(renaturation) 第四十一张，PPT共七十六页，创作于2022年6月Anfinsen实验-牛胰核糖核酸酶的变性和复性结论：蛋白质的变性是可逆的；一级结构决定三维结构；

17、形成三维结构所需要的所有信息都包含在一级结构中。第四十二张，PPT共七十六页，创作于2022年6月（四）蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。 * 蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜第四十三张，PPT共七十六页，创作于2022年6月+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉第四十四张，PPT共七十六页，创作于2022年6月蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中能成为稳定的胶体。如果在蛋白质

18、溶液中加入某种电解质或调节溶液pH，破坏了蛋白质的水化膜及中和了蛋白质的电荷，则蛋白质从溶液中析出的作用，称为蛋白质的沉淀作用。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。 根据反应的可逆性分为可逆沉淀和不可逆沉淀两种。（五）蛋白质的沉淀反应第四十五张，PPT共七十六页，创作于2022年6月1、可逆的沉淀作用定义：蛋白质发生沉淀后，用透析等方法除去沉淀剂，可使蛋白质重新溶于原来的溶液中。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。第四十六张，

19、PPT共七十六页，创作于2022年6月反应类型： （1）加高浓度盐类 : 如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等 盐析：加盐使蛋白质沉淀析出的现象 不同的蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，调节盐浓度可将混合蛋白质分段析出（分段盐析）。例： 半饱和的(NH4)2SO4可使球蛋白沉淀； 饱和的(NH4)2SO4可使清蛋白析出。 应用：利用此性质可分离和制备各种蛋白质和酶制品第四十七张，PPT共七十六页，创作于2022年6月（2）加有机溶剂：如酒精、丙酮等机理：有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀反应。（3）等电点沉淀 利用蛋白质的两性性质，在等电点时溶解度最小的特点。 在pI时，加入

20、这些有机溶剂可加速蛋白质的沉淀，可用于蛋白质的分离纯化。第四十八张，PPT共七十六页，创作于2022年6月定义：蛋白质发生沉淀后，不能用透析等方法除去沉淀剂而使蛋白质重新溶解的现象在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。2、不可逆沉淀第四十九张，PPT共七十六页，创作于2022年6月（六）蛋白质的颜色反应1、双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液

21、中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。2、米伦氏反应（酚基） 米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合物，蛋白质溶液加入此试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变为红色。酪氨酸含有酚基，故含酪氨酸的蛋白质都有此反应。第五十张，PPT共七十六页，创作于2022年6月3、乙醛酸反应（吲哚基） 在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两层之间就会出现紫色环。色氨酸及含有色氨酸的蛋白质有此反应。4、坂口反应 精氨酸分子含有胍基，能与次氯酸钠及-萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色产物。5、酚试剂（福林试剂）反应 酪氨酸中的酚基能将福林试剂中的磷

22、钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物。 该反应常用蛋白质的定量测定。第五十一张，PPT共七十六页，创作于2022年6月（五）蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。第五十二张，PPT共七十六页，创作于2022年6月前处理及抽提：选材、破碎、匀浆、溶解、离心或差速离心、（pH、温度、酶的抑制剂等保证蛋白质的稳定）。粗制品获得（粗分级分离）：盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离，离心。纯化（细分级分离）：层折法。鉴定和测定：纯度和含量。二、蛋白质的分离和分析技术（一）蛋白质分离纯化的一般

23、原则第五十三张，PPT共七十六页，创作于2022年6月1、透析及超滤* 透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。只用于除盐类和小分子杂质（二）常见分离纯化技术第五十四张，PPT共七十六页，创作于2022年6月透析(dialysis):磁力搅拌器透析前透析后透析袋通过透析，小分子通过透析袋，散布于透析液中，大分子量的蛋白质不能通过透析袋，留在透析袋内。从而，蛋白质溶液中的小分子物质通过透析被分离除去。第五十五张，PPT共七十六页，创作于2022年6月超过滤（ultrafiltration）加压蛋白质溶液半透膜支持膜的栅板超滤液原理:是利用压力或离心力，强行使水和

24、其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质留在半透膜上，以达到浓缩和脱盐的目的第五十六张，PPT共七十六页，创作于2022年6月2、盐析和盐溶*盐析(salt precipitation)：将高浓度的中性盐，如硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 盐溶（salt solution）：低浓度的中性盐可以使蛋白质溶解度增加。第五十七张，PPT共七十六页，创作于2022年6月等电点沉淀法：不同蛋白质、氨基酸组成不同，等电点不同，可利用等电点沉淀方法进行分离。等电点特点：蛋白溶解度最低3、等电点沉淀法第五十八张，PPT共七十六页，创作于2022年6月

25、4、低温有机溶剂沉淀法*常用有机溶剂：乙醇、丙酮*丙酮沉淀：使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离，否则蛋白易变性。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。 以上几种方法只能分离得到蛋白质的粗制品，还无法得到具有一定纯度的蛋白质。第五十九张，PPT共七十六页，创作于2022年6月5、电泳根据电荷不同进行纯化的方法蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。 第六十张

26、，PPT共七十六页，创作于2022年6月原点带负电荷蛋白质的泳动方向滤纸、醋酸纤维素薄膜或其他支持物阳极阴极电极缓冲液电极缓冲液电泳示意图薄膜电泳第六十一张，PPT共七十六页，创作于2022年6月几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。*等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳，以上两种方法相结合，是蛋白质组学研究的重要技术。第六十二张，PPT共七十六页，创作于2022年6月凝胶电泳第六十三张，PPT共七十六页，创作于2022年6月（四）层析（色谱）层析(chromatography)分离蛋白质的原理当流动相带着待分离蛋白质

27、溶液经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。第六十四张，PPT共七十六页，创作于2022年6月蛋白质分离常用的层析方法* 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析、分子排阻色谱等，是利用各蛋白质分子大小的不同进行分离的。亲和层析：是吸附层析，依赖于蛋白质和其配体（ligand）之间的相互作用来实现分离的。第六十五张，PPT共七十六页，创作于2022年6月阳离子交换层析过程离子交换树脂蛋白质高离子强度洗脱液洗高离子强度洗脱液洗加样平衡液洗