第四部分 生物化学与分子生物学技术实践

1、第四部分 生物化学与分子生物学技术实践高频考点突破考点一 血红蛋白的提取和分离1.蛋白质分离的依据 蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、 所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对 其他分子的亲和力等，可以用来提取和分离不同 种类的蛋白质。2.方法及原理 （1）凝胶色谱法原理 蛋白质比较相对分子质量大相对分子质量小凝胶内部不能进入能进入运动方式垂直向下垂直向下和无规则扩散运动经过路程较短较长洗脱次序先流出后流出提醒 凝胶色谱柱的直径大小不影响分离效果，但直径过大造成洗脱液体积大，样品稀释度大；凝胶色谱柱的高度与分离度有关。（2）凝胶电泳法原理凝胶电泳法的原理是不同蛋白质的带电性质、电量、

2、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。如下表：决定运动方向形成库仑力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小3.实验操作流程 红细胞洗涤离心去除血清 样品的处理 释放血红蛋白蒸馏水涨破 分离血红蛋白离心处理 粗分离透析（去除小分子杂质） 纯化凝胶色谱法进行分离和纯化 纯度鉴定SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相 对分子量提醒 红细胞洗涤过程中，洗涤三次后，上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则无法除去血浆蛋白；离心时转速要低，时间要短，否则白细胞等会一同沉淀，达不到分离效果。血红蛋白释放过程中，蒸馏水的作用是涨破红细胞，

3、甲苯的作用主要是溶解细胞膜。为了加快干凝胶的膨胀，可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至接近沸腾，通常只需12 h。这种方法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。滴加样品时，吸管管口要贴着管壁环绕移动，防止破坏凝胶面。对位训练1.为了提取血红蛋白，从学校附近的屠宰场索取新 鲜的猪血，对猪血处理的正确操作是 （ ） A.要在采血容器中预先加入抗凝血剂柠檬酸钠 B.取血回来后，马上进行高速长时间离心 C.将离心后的血细胞加入清水缓慢搅拌 D.重复洗涤直到上清液呈红色为止A2.洗涤红细胞时，离心所用方法为 （ ） A.低速长时间离心 B.低速短时间离心 C.高速

4、长时间离心 D.高速短时间离心B考点二 植物芳香油的提取1.植物芳香油的基本知识 （1）成分：组成较复杂，主要包括萜类化合物 及其衍生物。 （2）特点：具有很强的挥发性，易溶于有机 溶剂。 （3）应用：玫瑰精油是制作高级香水的主要成 分，能使人产生愉悦感；橘皮精油的主要成分是 柠檬烯，具诱人的橘香味，是食品、化妆品和香 水配料的优质原料。2.玫瑰精油的提取流程 鲜玫瑰花+清水水蒸气蒸馏油水混合物 分离油层 除水 玫瑰油3.玫瑰精油提取操作的关键 （1）安装装置顺序：从左到右，自下而上。 （2）温度计位置：温度计水银球的上限与蒸馏瓶 侧管的下限处在同一水平线上。 （3）冷凝管中的水流向：从下方进

5、水，上方出 水，与蒸气流向相反。加入NaCl加入无水Na2SO4过滤 （4）加热时防暴沸：垫石棉网，向液体中加入几粒沸石或瓷片。 （5）烧瓶内液体量：烧瓶容积的1/32/3。 （6）除水：加入无水Na2SO4后，放置时间可适当延长些。 （7）温度及时间：为提高产品质量，要严格控制蒸馏温度，可适当延长蒸馏时间。4.橘皮精油的提取流程 石灰水浸泡漂洗压榨过滤静置再次过 滤橘皮油5.橘皮精油提取操作的关键 （1）橘皮的处理：干燥后一定要用石灰水浸透， 时间至少10 h以上。 （2）压榨液的处理：可以先用普通布袋过滤除去 固体物和残渣，然后离心进一步除去质量较小的 残留固体物，再用分液漏斗或吸管将上层

6、的橘皮 油分离出来。对位训练3.植物芳香油易溶于 （ ） A.水 B.盐酸 C.碳酸 D.酒精D4.橘皮在压榨前，应用下列哪种液体浸泡（ ） A.石灰水 B.水 C.酒精 D.盐酸A考点三 蒸馏、压榨和萃取三种方法的比较提取方法水蒸气蒸馏压榨法有机溶剂萃取实验原理利用水蒸气将挥发性较强的芳香油携带出来通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发溶剂后就可获得芳香油方法步骤（1）水蒸气蒸馏（2）分离油层（3）除水过滤（1）石灰水浸泡、漂洗（2）压榨、过滤、静置（3）再次过滤（1）粉碎、干燥（2）萃取、过滤（3）浓缩适用范围适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油适用于柑橘、

7、柠檬等易焦糊原料的提取适用范围广，要求原料的颗粒要尽可能细小，能充分浸泡在有机溶液中优点简单易行，便于分离生产成本低，易保持原料原有的结构和功能出油率高，易分离局限性水中蒸馏会导致原料焦糊和有效成分水解等问题分离较为困难，出油率相对较低使用的有机溶剂处理不当会影响芳香油的质量提醒 水蒸气蒸馏要适当延长蒸馏时间，温度不能太高。用于萃取的有机溶剂必须事先精制，除去杂质。压榨时原料必须要浸透，这样压榨时不会滑脱，出油率高，不堵塞筛眼；使用石灰水充分浸泡原料，破坏细胞结构，分解果胶，防止橘皮压榨时滑脱，提高出油率。对位训练5.我们选择提取玫瑰精油的方法是 （ ） A.水气蒸馏 B.压榨法 C.水中蒸馏

8、 D.萃取法C6.橘皮精油提取时一般采用 （ ） A.水中蒸馏 B.压榨法 C.水上蒸馏 D.萃取法B考点四 PCR扩增技术与体内DNA复制1.PCR的反应过程 （1）变性：当温度上升到90以上时，双链DNA 解旋为单链，如下图： （2）复性：温度下降到50左右，两种引物通 过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：（3）延伸：温度上升到72左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：2.PCR扩增技术和DNA复制的比较DNA复制PCR扩增技术场所细胞核内生物体外原理碱基互补配对碱基互补配对酶DNA聚合酶、解旋酶耐热的DNA聚合酶（Taq

9、酶）条件模板、ATP、引物链（RNA）、常温模板、ATP、引物链（DNA及RNA片段）、温度变化（909555607075）原料四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸特点形成的是整个DNA分子，一个细胞周期只复制一次短时间内形成大量目的基因DNA片段，呈指数增长2n对位训练7.标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大 步，这三大步需要的温度依次是 （ ） A.92、50、72 B.72、50、92 C.50、92、72 D.80、50、72A8.引物的作用是 （ ） A.打开DNA双链 B.催化合成DNA子链 C.使DNA聚合酶能够从引物的3端开始复制 D.提供模板C思维方法探究思维误区警示易错分析

10、 蛋白质提取与分离的原理不清楚方法原理凝胶色谱法根据相对分子质量的大小分离蛋白质电泳法根据各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同进行分离纠正训练 使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中，相对分子质 量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程，可表示为 图中 （ ）B知识综合应用重点提示 通过“胡萝卜素的提取与鉴定实验”的考查，提升“用文字、图表以及数学的方式等多种形式准确地描述生物学方面的内容”的能力。典例分析 如图为提取胡萝卜素的装置图，请 据图回答下列问题： （1） 的作用是 。 （2） 内加入的萃取液一般是 ， 原料在加入前，一般要进行 、 处理。 （3）该萃取过程采用的是水浴加热，其目的是

11、。 （4）为了取得最佳萃取效果，萃取的时间应该 。解析 图示装置为萃取装置，其中为冷凝管，其作用在于降温，以防止加热时有机溶剂挥发，是烧瓶，其内装有萃取剂，胡萝卜素的适宜萃取剂是石油醚，为防止有机溶剂明火加热时引起燃烧、爆炸，萃取时有必要采用水浴加热，而不用明火加热。答案 （1）冷凝管 降温，防止加热时有机溶剂挥发 （2）烧瓶 石油醚 粉碎 干燥 （3）避免使用明火加热引起燃烧、爆炸 （4）长拓展提升 比较萃取装置与水中蒸馏装置（1）两种装置中均具冷凝装置，但放置的方式和作用不同。蒸馏装置比萃取装置多了接收瓶及牛角管，且设有温度计以检测蒸气温度。（2）蒸馏装置中，烧瓶中装的蒸馏水可直接加热，而

12、萃取装置中装的是有机溶剂（萃取剂），故不可直接加热（需水浴加热）。变式训练 右图为胡萝卜素的纸层析结果示意图，请据图回答问题：（1）该图所示的鉴定方法称为 。（2）基线一般距底边 cm。（3）A、B、C、D四点中，属于标准样品的样点是 ，属于提取样品的样点是 。点样的要求是 。（4）在图中的层析谱中，代表的物质是 ，代表的物质是 。（5）该层析的目的是 ，而在“绿叶中色素的提取和分离”的实验中层析的目的是 。解析 该图为胡萝卜素的纸层析结果示意图，所示的鉴定方法为纸层析鉴定法。基线一般在滤纸下端距底边2 cm处，在基线上取A、B、C、D四点，用最细的注射器针头分别吸取标准样品和提取样品，在A、

13、D和B、C点上点样，点样应快速细致，在基线上形成直径为2 mm左右的圆点，每次点完后可以用吹风机吹干，注意保持滤纸干燥。图中和分别是标准样品-胡萝卜素和分离出的其他色素及杂质。答案 （1）纸层析鉴定法 （2）2 （3）A和D B和C 点样应该快速细致，圆点细小，每次点样时滤纸都要干燥 （4）-胡萝卜素 其他色素和杂质（5）胡萝卜素粗品的鉴定 提取并分离叶绿体中的色素，探究色素的种类和颜色定时检测1.2008年5月20日民政部等制订汶川大地震遇难人 员遗体处理意见指出，无法确认遇难者身份的， 由公安部门提取可供DNA检验的检材以便事后身 份辨认。事后的遗体辨认可借助于DNA杂交技 术，即从遗体细

14、胞与死者家属提供的死者生前生 活用品中分别提取DNA，然后借助DNA杂交技术对 遗体进行确认。据此回答： （1）为了确保辨认的准确性，需要克隆出较多的 DNA样品。这需借助PCR技术。使用PCR技术的具体实验操作顺序是：按配方准备好各组分 离心使反应液集中在离心管底部设计好PCR仪的循环程序进行PCR反应。请写出图中方框的步骤： ，该步操作应特别注意的问题是 。A组B组C组遗体中的DNA碱基序列ACTGACGGTTGGCTTATCGAGCAATCGTGC家属提供的DNA碱基序列TGACTGCCAACCGAATAGCACGGTAAGACG（2）上表所示为分别从死者遗体和死者生前的生活用品中提取的

15、三条相同染色体上的同一区段DNA单链的碱基序列，根据碱基互补配对情况进行判断，A、B、C三组DNA中不是同一人的是 。（3）为什么从死者体细胞与死者家属提供的其生前生活用品中分别提取的DNA可以完全互补配对？ 。解析 PCR技术是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。这项技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题，被广泛地应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等领域。DNA杂交技术方法是从遗体细胞和死者家属提供的死者生前的生活用品中分别提取DNA，在一定温度下，水浴共热，使DN

16、A氢键断裂，双链打开。若两份DNA样本来自同一个体，在温度降低时，两份样本中的DNA单链通过氢键连接在一起，若不是来自同一个体，则两份样本中的DNA单链在一定程度上不能互补，DNA杂交技术就是通过这一过程对面目全非的死者进行辨认的。答案 （1）用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分PCR实验使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌（2）B、C （3）人体所有体细胞均由一个受精卵有丝分裂产生，其细胞核中均含有相同的遗传物质2.对血红蛋白（Hb）的研究结果表明，血红蛋白实际 上是由珠蛋白、原卟琳和二价铁离子（Fe2+）所组 成的结合蛋白质，由4条肽链各结合一个辅基即血

17、红素，O2结合于Fe2+上，血红蛋白与氧疏松结合形 成氧合血红蛋白（HbO2），这种氧合作用在氧分压 高时容易进行，在氧分压低时易于解离。红细胞结 合和携带O2的过程并不影响Fe2+，也就是说不会使 之氧化为Fe3+。Fe3+无携带O2的能力。CO与Hb的亲和 力大于O2，结合成HbCO后不能分离，致使Hb丧失运 输O2和CO2的机能，这称为一氧化碳中毒即煤气 中毒。（1）用凝胶色谱法分离血红蛋白时，待 接近色谱柱底端时，才用试管收集。血红蛋白因含 而呈现红色。（2）要使血红蛋白从红细胞中释放出来，可选用的方法是 。（3）红细胞具有运输氧的功能，是因为 。（4）亚硝酸盐为强氧化剂，进入人体后，

18、可使血红蛋白失去运输氧的功能，导致人体组织缺氧，其可能的原因是 。解析 用凝胶色谱法分离血红蛋白时，血红蛋白因含血红素而呈现红色，待红色区带接近色谱柱底端时，才用试管收集。将红细胞置于蒸馏水中，加40%体积的甲苯，搅拌使红细胞破裂并释放出血红蛋白。红细胞中的血红蛋白与氧在氧分压高时容易结合，在氧分压低时又容易分离。亚硝酸盐可将血细胞中低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，从而使其失去与氧结合的能力。答案 （1）红色区带 血红素 （2）将红细胞置于蒸馏水中，加40%体积的甲苯，搅拌使之破裂并释放血红蛋白（3）红细胞中的血红蛋白与氧在氧分压高时容易结合，在氧分压低时又容易分离 （4）亚硝酸盐可使血细胞中

19、低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白3.PCR（聚合酶链式反应）技术是一项在生物体外 复制特定的DNA片段的核酸合成技术，下图表示 合成过程，请据图分析回答： （1）A过程高温使DNA变性解旋，对该过程的原理 叙述，正确的是 。 A.该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键 B.该过程用到限制性核酸内切酶破坏磷酸二酯键 C.该过程不需要解旋酶的作用 D.该过程与人体细胞的过程完全相同（2）C过程要用到的酶是 。这种酶在高温下仍保持活性，因此在PCR扩增时可以 加入， （需要/不需要）再添加。PCR反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有： 。（3）如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记

20、，控制“94-55-72”温度循环3次，则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占 。 （4）如果模板DNA分子共有a个碱基对，其中含有胞嘧啶m个，则该DNA复制10次，需要加入胸腺嘧啶脱氧核苷酸 个。（5）PCR中由碱基错配引起的变异属于 。假设对一个DNA进行扩增，第一次循环时某一条模板链上发生碱基错配，则扩增若干次后检测所用DNA的扩增片段，与原DNA相应片段相同的占 。解析 （1）高温所起的作用类似于解旋酶，使双链DNA变为单链。（2）C过程为PCR技术的延伸阶段，当系统温度上升至72左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。Taq DNA聚合酶是耐热的，

21、高温下不变性，所以一次性加入即可。（3）PCR技术遵循半保留复制的特点。经过三次循环，共产生23个DNA分子，其中有2个DNA分子含有15N标记。（4）在一个双链DNA分子中，C+T占碱基总数的一半，故T的数目为a-m，复制10次，相当于新增加了210-1个DNA分子。故需补充T的数目为（210-1）（a-m）。（5）基因中的碱基对改变属于基因突变。对一个DNA进行扩增，第一次循环时某一条模板链上发生碱基错配，以后按正常配对方式进行扩增，错配链作模板扩增的都是错误的DNA分子，原正常链扩增得到的DNA分子都是正常的DNA分子，故若干次后检测所用DNA的扩增片段，与原DNA相应片段相同的占3/4

22、。答案 （1）C （2）Taq DNA聚合酶 一次 不需要 DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行 （3）25% （4）（210-1）（a-m） （5）基因突变 75%4.红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是 由血红蛋白完成的，血红蛋白的主要功能是携带 O2或CO2，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动 物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请 回答下列有关问题： （1）血红蛋白提取和分离的程序可分为四步： 、 、 和 。 （2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器 中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白

23、溶液。 加入柠檬酸钠的目的是 。 以上所述的过程即是样品处理，它包括 、 、收集血红蛋白溶液。（3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。透析的目的是 。透析的原理是 。（4）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。样品纯化的目的是 。血红蛋白有什么特点？ 。这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？ 。解析 本题主要考查蛋白质分离与鉴定的基本原理及实验流程。分离、提取血红蛋白的实验流程大致是样品处理粗分离纯化纯度鉴定四个步骤。柠檬酸钠属于抗凝剂。血红蛋白是红色含铁的蛋白质。凝胶色谱法分离蛋白质是依据蛋白质的相对分子质量大小来进行的

24、。答案 （1）样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定（2）防止血液凝固 红细胞的洗涤 血红蛋白的释放（3）去除相对分子质量较小的杂质 透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内（4）通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去 血红蛋白呈现红色 在用凝胶色谱法分离时可以通过观察颜色来判断什么时期应该收集洗脱液；这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作5.血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成 成分，负责血液中O2和部分CO2的运输。请根据血 红蛋白的提取和分离流程图回答问题。 （1）将实验流程补充完整：A为 ，B为 。 凝胶色谱法的基本原理是根据 而达到 蛋白质分离的有效方法。（2

25、）洗涤红细胞的目的是去除 ，洗涤次数过少，无法除去 ；离心速度过高和时间过长会使 一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是 。释放血红蛋白的过程中起作用的是 。（3）在洗脱过程中加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）的目的是 。如果红色区带 ，说明色谱柱制作成功。答案 （1）血红蛋白的释放 样品的加入和洗脱相对分子质量的大小 （2）杂蛋白（血浆蛋白）血浆蛋白 白细胞和淋巴细胞 离心后的上清液中没有黄色 蒸馏水和甲苯 （3）准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内的一致 均匀一致的移动6.请回答下列与实验室提取芳香油有关的问题： （1）植物芳香油的提取可采用

26、的方法有压榨法、 和 。 （2）芳香油溶解性的特点是不溶于 ， 易溶于 ，因此可用 作为提取剂来 提取芳香油。 （3）橘子果实含有芳香油，通常可用 作为 材料提取芳香油，而且提取时往往选用新鲜的材 料，理由是 。 （4）对材料压榨后可得到糊状液体，为除去其中的 固体物获得乳状液可采用的方法是 。（5）得到的乳状液加入氯化钠并放置一段时间后，芳香油将分布于液体的 层，原因是 。加入氯化钠的作用是 。（6）从乳状液中分离得到的芳香油中要加入无水硫酸钠，此剂的作用是 。答案 （1）蒸馏法 萃取法 （2）水 有机溶剂有机溶剂（3）橘子皮 芳香油含量较高 （4）过滤（5）上 油层的密度比水层小 增加水层

27、密度，使油和水分层（6）吸收芳香油中残留的水分7.阅读以下材料，回答相关问题： 从玫瑰花中提取出的玫瑰精油被称为“液体黄 金”，是世界香料工业不可取代的原料，多用于 制造高级香水、化妆品等。提取出的玫瑰精油不 含有任何添加剂或化学原料，是纯天然的护肤 品，具有极好的抗衰老和止痒作用，能够促进细 胞的再生、防止肌肤老化、抚平肌肤细纹，还具 有使人放松、愉悦心情的功效。玫瑰精油的化学 性质稳定，难溶于水，易溶于有机溶剂，挥发性 较强。（1）根据材料中介绍的玫瑰精油的性质，要提取玫瑰精油可以用水中蒸馏和 法提取，但一般采用水中蒸馏的方法，其原因是该法具有 的优点。（2）某同学在实验中设计了如图所示的装置提取玫瑰精油，指出该装置中的两个错误，并予以改正。错误1： ；改正： 。错误2： ；改正： 。（3）对用上述装置接收到的乳浊液进行如下处理：玫瑰油与水的混合物 分层 油层 无水玫瑰精油 较纯净的玫瑰精油。试剂A是 ，试剂C是 ，装置B是 ，试剂C的作用是 。（4）要在短期内获得大量的优良玫瑰苗可采用植物组织培养技术，请回答下列问题：要培养脱毒苗，应选用 部分作为培养材料。利用无性繁殖技术繁殖植物的优点是 。试剂A装置B试剂C过滤解析 （1）应根据原料特点来选择提取方法