文献阅读-生物被膜Bacterial biofilm与阿奇霉素（已）

1、汇报人：XXX细菌生物被膜与阿奇霉素-阿奇霉素对生物被膜形成影响的研究20XX目录contents1细菌生物被膜3阿奇霉素对生物被膜形成影响的研究2阿奇霉素01细菌生物被膜Bacterial biofilm细菌生物被膜Bacterial biofilm生物被膜的含义1978年由J. William Costerton首次通过电镜方法首次观察到并提出的。生物被膜（biofilm）：指细菌自身产生的外部多糖基质、纤维蛋白质、脂蛋白等包裹着的菌细胞的结构。Bacteria In A Biofilm Photograph by Kateryna Kon细菌生物被膜Bacterial biofilmBi

2、ofilms the Barriers of Bacteria | Ali Miller RD细菌生物被膜Bacterial biofilm根据细菌在BF内位置不同可分为：游离菌、表层菌和里层菌。游离菌与表层菌比较相似，它们相对容易获得营养和氧气，代谢通常比较活跃，菌体较大；而里层菌被包裹于多聚糖中，其养料的获取及代谢只能通过周围的间质水道进行，代谢率较低，多处于休眠状态，一般不进行频繁地分裂，菌体较小。细菌生物被膜Bacterial biofilm组成 胞外多糖（EPS）=多糖+核酸+蛋白含水量高 ，呈凝胶样EPS粘附性强，可吸附营养物质。将细菌个体粘附起来，使细菌在流体环境中定居在某一物体

3、表面。随着生物被膜的成熟，含量越来越多。细菌生物被膜Bacterial biofilm细菌粘附细菌增殖生物被膜成熟脱落和再生形成过程细菌生物被膜Bacterial biofilm形成过程Bacterial Biofilms: Development, Dispersal, and Therapeutic Strategies in the Dawn of the Postantibiotic Era 细菌生物被膜Bacterial biofilm形成过程黏附: 细菌通过自身鞭毛及纤毛或外层蛋白与宿主表面进行粘连、黏附， 此时与细菌营养状况、氧浓度、渗透压、pH 值及温度等相关。该阶段前期， 具

4、有一定 的 可 逆 度， 至 后 期， 当 逐 步 分 泌 胞 外 多 糖( expolysaccharide， EPS) ， 便逐渐转变为不可逆性黏附。细菌生物被膜Bacterial biofilm形成过程增殖: 此时已不可逆， 宿主表面细菌开始增殖，且开始通过释放化学物质进行信息交流， EPS 分泌逐渐增多并包覆于细胞表面时 BF 增厚， 移动性降低， 且有研究指出， BF 增厚现象主要由细菌繁殖所致细菌生物被膜Bacterial biofilm形成过程成熟: 菌落继续扩大并形成立体结构， 细菌分泌的 EPS 使 BF 与细菌自身紧密相连， 在避免两者出现脱离等情况的同时， 也使其具有一定

5、抗压能力， 该阶段细菌群体感应通过对细菌密度等情况的监测， 对其靶基因的表达起一定的调节作用， 进而调控细菌的营养物质获取、细菌杂交和废物运输细菌生物被膜Bacterial biofilm形成过程解聚再定植: 随着细菌 BF 的逐步形成， 细菌开始出现脱离现象， 部分变为浮游菌， 它们游离于机体组织内， 并寻找新的宿主环境。以形成新的定植菌， 并再次进行以上过程。但不同的培养条件、菌株、基因型以及载体的免疫状况的差异， 导致其内部结构及生长状态等出现较大差异。细菌生物被膜Bacterial biofilm影响形成的因素菌毛。有研究发现，无菌毛的流感嗜血杆菌变异株，形成 BF 的能力大大下降，

6、仅可达到正常水平的 1/3 或 1/4。脂寡糖。如流感嗜血杆菌从外部摄取 N-乙酰神经氨酸( 一种脂寡糖) 后，可使 LOS 唾液酸化，不能唾液酸化的菌株， 形成 BF 的能力以及 BF 的黏附时间都会下调。蛋白质。如大肠埃希菌的溶血素表达调节蛋白通过抑制具有减少菌毛生成的稀有密码子 tNAs 的转录，可抑制菌毛基因 fim A 及 ihfA 的转录，从而显著减少生物膜的形 成。细菌生物被膜Bacterial biofilm影响形成的因素群 体 感 应 系 统。群 体 感 应 系 统( quorum sensing，QS) 是细菌自身产生 的 自 诱 导 分 子( autoinducer，AI

7、) ， 通过 AI 过渡，对外周细菌的密度进行感应，流感嗜血杆菌 BF 内细菌密度上升，导致 AI 浓度也随之升高到一定程度时，菌落自身将采取相应措施，以调控基因的表达，适应外界环境。目前，将该系统细分为双组份感应系统、AHL-Lux I /Lus 系统及 QS 系统三大类，而三种系统中若有某一个系统出现异常，均可导致 QS 的稳定性出现异常，比如一旦群体信号通路的其中一个决定因素 luxs 出现突变就会导致相应突变菌株的细菌膜密度降低。有学者提出，流感嗜血杆菌与卡他莫拉菌通过群体感应系统形成的细菌膜对抗生素的耐药性更强。DNA。DNA 在生物膜中为网状致密结构， 构成其框架， 对其使用脱氧核

8、糖核酸酶后， BF 结构变得松散， 更易去除细菌生物被膜Bacterial biofilm耐药性机制被膜下细菌代谢低下，呈“亚冬眠状态”阻止机体免疫系统对细菌的清除，产生免疫逃逸现象。阻滞抗生素的渗透吸附抗生素灭活酶，促进抗生素水解细菌生物被膜Bacterial biofilm相关感染能生成生物被膜的主要细菌有铜绿假单胞菌、克雷伯氏菌，肠杆菌、肺炎链球菌、葡萄球菌等，相关感染以铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌多见。生物医学材料相关感染：导尿管相关泌尿系统感染；心脏外科生物材料植入术合并感染；机械通气患者气管插管处有细菌定植并反复发生感染；大静脉导管, 伤口引流管, 人工关节置入等相关感染慢性生物被

9、膜疾病：慢性阻塞性肺疾病（COPD) 肺囊性纤维化(CF)支气管扩张；弥漫性泛细支气管炎(DPB)；亚急性细菌性心内膜炎；慢性骨髓炎；感染性肾结石张晓东，14,15环-大环内酯类药物在清除铜绿假单胞菌生物膜中的作用，西部药学，2015,17（6）细菌生物被膜Bacterial biofilm相关感染特点极强的耐药性;病程的长期性，反复感染; 逃避宿主的细胞免疫和体液免疫张晓东，14,15环-大环内酯类药物在清除铜绿假单胞菌生物膜中的作用，西部药学，2015,17（6）02阿奇霉素阿奇霉素15元环大环内酯类，即氮内脂类的第一个品种。阿奇霉素与核糖体50s亚基 23SrRNA结合，阻止肽酰基tRN

10、A和mRNA自A位移向P位，阻止新的氨酰基tRNA结合至A位，选择性抑制细菌蛋白质合成。与细菌核糖体50s亚基的L22蛋白质直接结合核糖体结构破坏肽酰tRNA在肽链延长阶段较早从核糖体上解离阿奇霉素抗菌谱：革兰阳性菌需氧菌，如金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌（A组-溶血性链球菌）、肺炎球菌、-溶血性链球菌等。革兰阴性需氧菌，如流感、副流感嗜血杆菌、卡他菌、不动杆菌属等，对大肠杆菌、肠杆菌属活性不尽相同，需进行敏感性试验。厌氧菌，如类杆菌属、产气荚膜杆菌、消化球菌属等性传播疾病，如沙眼衣原体、淋病奈瑟菌等其他微生物，如肺炎衣原体、肺炎支原体、脲素脲原体、单核细胞增多性李斯德杆菌等阿奇霉素抗菌活性：对

11、革兰阴性菌的抗菌活性较红霉素强（其中对流感嗜血杆菌、淋病奈瑟球菌的抗菌作用较红霉素强4-8倍；对卡他莫拉菌的抗菌作用较红霉素强2-4倍）对葡萄球菌属、链球菌属等革兰阳性球菌的抗菌作用较红霉素略差对肺炎支原体作用是大环内酯类抗生素中最强的阿奇霉素阿奇霉素进入组织较慢，48 小时后血浆内浓度可达最高峰，在组织中分布迅速，释放缓慢。阿奇霉素有较低的血浆浓度（0.5 g剂量之后，为0.4 ug/ml），而在痰液，肺组织、扁桃体、鼻窦、胃、子宫、卵巢和前列腺等组织中达到及其高的浓度。在这些组织中的阿奇霉素浓度比血浆中的浓度高10150倍。在肺部、生殖器和淋巴组织中的浓度最高，在中性粒细胞等细胞内的浓度为

12、细胞外的79倍，而在脂肪、肌肉和骨组织中浓度偏低。独特的药代动力学特征阿奇霉素本品在组织中释放缓慢，平均消除半衰期为24天，可使阿奇霉素在组织中保持较高的有效浓度，即使血浆浓度低于MIC时也可在组织中维持有效浓度。因而阿奇霉素可使用一个相对较短的疗程。阿奇霉素的吞噬细胞传递机制，即给药后阿奇霉素迅速集中到多形核白细胞中(PMN) 及巨噬细胞中，随着吞噬细胞的迁移将其转运至感染部位，使感染组织中具有很高的浓度，并保持一个很长的时间，然后作为一个对病原菌存在的应答，再将其释放出来，浓度超过很多病原菌的最小抑菌浓度(MIC)。它的组织半衰期较长，超过60小时，由于其消除较慢，所以口服阿奇霉素35天其

13、血药浓度、血中游离药物浓度和组织游离浓度较高。独特的药代动力学特征阿奇霉素抗生素后效应（PAE）是指细菌与抗生素短暂接触后，药物浓度降至MIC 以下或消除后细菌生长仍受持续抑制的效应。其产生的机制，一般认为是抗生素与细菌靶位持续性结合，引起细菌非致死性损伤或抗生素后促白细胞效应。阿奇霉素属于典型的具有抗生素后效应的药物，其在低于或高于MIC 时, 均可促进吞噬细胞对细菌的吞噬作用，作用机制可能是其导致细菌非致死性损伤或持续性与靶位结合，显著延长了细菌的恢复再生长的时间。此外与细菌接触后，使得菌体变形，易被吞噬细胞识别，促进杀菌物质的释放，产生于促白细胞效应，增大细胞损伤程度，延长修复时间。抗生

14、素后效应阿奇霉素有实验证实，服用阿奇霉素35天后第12天时白细胞及吞噬细胞内仍能测到一定浓度，10天后血清内仍有0.30.6 ug/L，根据不同致病菌对阿奇霉素有不同的MIC90数值，阿奇霉素代谢到第4天后其浓度低于该菌的MIC90时，就在第4天前开始再服第二次药(如病情需要)。对肺炎支原体肺炎来说，服用10 mg/(kgd)用 3 天，在第10天即停药7天后阿奇霉素血清浓度已在0.30.6 ug/L，而肺炎支原体对阿奇霉素的MIC90是0.020.40 ug/L。因此在停药 7 天后应服第二次药，如对肺炎链球菌，则停 4 天就须服第 2 次，停 7 天就太长，达不到需要的浓度，效果会差。为确

15、保疗效，一般服三停四。抗生素后效应阿奇霉素儿童肺炎支原体肺炎诊治专家共识（2015年版）阿奇霉素每日仅需1次用药，使用天数较少，生物利用度高以及细胞内浓度高，依从性和耐受性均较高，已成为治疗首选。阿奇霉素用法：10 mg/(kgd)，qd，轻症3 d为1个疗程，重症可连用57 d，4 d后可重复第2个疗程，但对婴儿，阿奇霉素的使用尤其是静脉制剂的使用要慎重。临床应用阿奇霉素儿童社区获得性肺炎诊疗规范（2019年版）对流感嗜血杆菌，阿奇霉素的耐药菌株在不断增多，已超过30%。对流感嗜血杆菌的治疗首选阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦或阿莫西林/舒巴坦，对氨苄西林耐药时可以选用头孢呋辛或头孢曲松

16、等，或新一代大环内酯类抗菌药物，如阿奇霉素、克拉霉素等。肺炎支原体：首选阿奇霉素。10 mg/(kgd)，qd，轻症3 天为1个疗程，重症可连用57 天，23天后可重复第2个疗程；但婴儿使用阿奇霉素，尤其是静脉制剂要慎重。临床应用阿奇霉素成人社区获得性肺炎基层诊疗指南（2018年）指南指出我国肺炎链球菌及肺炎支原体对大环内酯类药物耐药率高，肺炎支原体对阿奇霉素的耐药率为54.9-60.4。指南中没有单独推荐阿奇霉素的使用，推荐大环内酯类药物使用。对于需要住院的CAP患者，推荐单用-内酰胺类或联合多西环素、米诺环素、大环内酯类或单用呼吸喹诺酮类，不需要皮试。临床应用阿奇霉素慢性阻塞性肺疾病急性加

17、重抗感染治疗中国专家共识应根据危险分层和铜绿假单胞菌感染风险制定抗感染方案。单纯慢阻肺可选用大环内酯类（阿奇霉素、克拉霉素），第一代或第二代头孢菌素（如头孢呋辛）等治疗。临床应用阿奇霉素2020 GOLD 慢性阻塞性肺疾病（COPD）全球倡议最近有研究表明，有规律的使用一些抗菌药物可能减少COPD患者急性加重。相对于常规组，在有急性加重趋向的患者中，阿奇霉素（250mg/天或500mg，3次/周）或红霉素（500mg 2次/天）治疗1年，可减少急性加重的风险。但是阿奇霉素可以增加细菌耐药性，QT间期延长，听力损害。一项事后分析显示，吸烟者获益较少。目前没有研究评价阿奇霉素长期治疗1年以上对预防

18、急性加重的有效性和安全性。临床应用阿奇霉素抗菌外作用：除抗菌效应外，阿奇霉素还有抗炎作用、免疫调节、生物膜破坏、气道黏液调节、改变巨噬细胞表型和气道表面液体电解质的调节。有研究报道长期低剂量阿奇霉素在慢性感染肺疾病中的作用。对COPD、哮喘、支气管扩张症有明确的获益性。其抗菌外作用在临床中的存在巨大的潜力与发展空间。临床应用阿奇霉素阿奇霉素在呼吸系统疾病中具有免疫调节、抗炎作用（超说明书用药）弥漫性泛细支气管炎(DPB)：Li Huiping等从2001年7月到2007年4月回顾性研究了阿奇霉素在51位患有DPB患者的临床疗效，证明阿奇霉素治疗弥漫性泛细支气管炎患者是有效的，且耐受性良好。 囊

19、性肺纤维化：Carr Roxane R等回顾性研究了185个患有肺囊性纤维化的病人(儿童和成人)，在3 - 6个月时间给予阿奇霉素治疗，剂量范围从每周3次250毫克到500毫克每天。试验结果表明阿奇霉素似乎改善成人肺功能和年长的孩子囊性纤维化，耐受性良好。但还需要进一步的研究来确定最佳给药方案,持续治疗对患者生活质量的影响及阿奇霉素治疗的成本效益。闭塞性细支气管炎1张碧丽，大环内酯类抗生素的免疫调节作用研究进展，天津医药，2013年4月，41（4）2凌兰，大环内酯类抗生素在呼吸系统疾病中的抗炎作用，中日友好医院学报，2009，23（4）3Li Huiping，Effect of azithro

20、mycin on patients with diffuse panbronchiolitis: retrospective study of 51 cases，Internal Medicine ，2011，1663-9临床应用阿奇霉素支气管扩张：Wong Conroy等通过随机、双盲试验研究表明阿奇霉素可作为在过去一年中至少发生过一次恶化的诊断为非囊性纤维化支气管扩张患者治疗的新选项。慢性阻塞性肺疾病（COPD）：Pomares Xavier等回顾性研究了12个月内间歇性给予阿奇霉素（每周3次，每次500毫克）治疗严重慢性阻塞性肺疾病或每年至少4次急性发作或有铜绿假单胞菌定植危险因素的患者

21、的获益情况，试验证明长期间歇性给予阿奇霉素治疗，能够减少严重慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者恶化的频率；通过对照试验证明长期应用阿奇霉素有很好的耐受性，能够使与慢性阻塞性肺疾病急性发作期的患者和中重度 COPD 患者的住院时间显著减少5Wong Conroy，Azithromycin for prevention of exacerbations in non-cystic fibrosis bronchiectasis (EMBRACE): a randomised, double-blind, placebo-controlled trial，The Lancet，2012：660-76P

22、omares Xavier，Long-term azithromycin therapy in patients with severe COPD and repeated exacerbations，The International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease (Online)，2011:449-56临床应用阿奇霉素阿奇霉素在呼吸系统疾病中具有免疫调节、抗炎作用作用机制1对细胞因子和趋化因子的作用2对转录因子（NF）-kb 及细胞凋亡的作用3对细胞信号转导作用4对细胞表面黏附因子的作用张碧丽，大环内酯类抗生素的免疫调节作

23、用研究进展，天津医药，2013年4月，41（4）阿奇霉素临床试验中所见显著异常的实验室检查（无论是否与药物有关）为：发生率46%：丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、肌酐升高。发生率 13%：乳酸脱氢酶（LDH）、胆红素升高。发生率低于 1%：白细胞减少、中性粒细胞减少、血小板计数减少、血清碱性磷酸酶升高。随访发现上述实验室检查异常为可逆性。在 750 多例患者参加的阿奇霉素（静脉/口服）多剂给药临床试验中，不超过 2%的患者因治疗相关性肝酶异常而停用阿奇霉素。不良反应阿奇霉素一般事项：由于阿奇霉素主要经肝脏清除，故肝功能损害的患者应慎用阿奇霉素。GFR 10mL/mi

24、n 的受试者的资料有限，这类患者也应慎用阿奇霉素。特殊人群（肾功能不全）曾有肝功能异常、肝炎、胆汁淤积性黄疸、肝坏死和肝衰竭的报道，其中某些病例可能致死。如果出现肝炎的体征和症状，应立即停用阿奇霉素。应考虑高危人群QT间期延长的风险，阿奇霉素在 FDA 妊娠药物分类中属 B 类，妊娠时应用阿奇霉素需有确切的指征。目前尚不知阿奇霉素是否经乳汁分泌。因许多药物经乳汁分泌，故哺乳期妇女应用阿奇霉素时应予注意。注意事项03阿奇霉素对生物被膜形成的影响阿奇霉素对生物被膜形成的影响体外研究举例：大环内酯类对细菌生物被膜的影响鸟苷二磷酸-D-甘露糖脱氢酶藻酸盐14、15环-大环内酯类药物减少细菌纤毛的数量和

25、纤毛的粘附阿奇霉素对生物被膜形成的影响大环内酯类在治疗铜绿假单胞菌慢性感染方面主要具有：（1）抑制铜绿假单胞菌藻酸盐和表多糖的产生；（2）影响铜绿假单胞菌III型分泌系统，减少毒力因子的产生；（3）破坏铜绿假单胞菌表面结构，抑制细菌对宿主的黏附；（4）抑制细菌QS（密度感应系统）系统，减少自身信号诱导分子的合成；（5）增加呼吸道痰液的清除降低痰液粘稠度；（6）对铜绿假单胞菌具有暴露时间依从性杀菌活性等方面功能，能最终达到对铜绿假单胞菌慢性感染的有效控制。万珍燕，大环内酯类药物治疗铜绿假单胞菌慢性感染机制的研究进展，2008.33（5）阿奇霉素对生物被膜形成的影响文献对阿奇霉素单药或与其他抗菌药

26、物联用对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响作用研究报道较多，部分文献研究报道了阿奇霉素对金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌等细菌生物被膜形成的抑制作用。阿奇霉素对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用对阿奇霉素对金黄色葡萄球菌独立因子和生物被膜的影响作了研究考察，表明阿奇霉素对金黄色葡萄球菌悬浮菌具有较好的抗菌和杀菌活性，对生物被膜相对较弱，进一步验证了阿奇霉素对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的影响，对生物被膜的形成具有较好的抑制作用。有助于治疗由金黄色葡萄球菌的治疗。阿奇霉素对铜绿假单胞菌生物被膜和毒力因子的干预作用及机制研究 中，研究了阿奇霉素通过干预铜绿假单胞菌QS（密度感应系统）的调控干预生物被

27、膜的形成及抑制细菌毒力因子的产生。1邢明勋，阿奇霉素对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用，中国药科大学学报，2012，432简丽娟，阿奇霉素对铜绿假单胞菌生物被膜和毒力因子的干预作用及机制研究 ，广西医科大学，2011阿奇霉素对生物被膜形成的影响文献1 研究报道了阿奇霉素对铜绿假单胞菌生物被膜的抑制作用，结果表明未用阿奇霉素的硅胶片上较厚的生物被膜的形成，而应用阿奇霉素后可见生物被膜较对照组薄且有碎裂，且其变化与阿奇霉素的浓度相关，结论示：阿奇霉素可能抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成，为临床治疗提供依据。本文章显示了阿奇霉素对生物被膜形态学变化的影响，如何将形态学改变定量未做解决。文献2研究表明阿

28、奇霉素对流感嗜血杆菌气道导管早期生成生物被膜有一定的抑制作用。1徐莉莉，阿奇霉素对铜绿假单胞菌生物被膜的抑制作用，中国现代医学杂志，2005.4。15（8）12王瑛，阿奇霉素对气管导管内流感嗜血杆菌生物被膜的影响 ，重庆医学，2016.1.45（1）阿奇霉素对生物被膜形成的影响体外研究情况总结体外研究医用材料的材质以及结构被附着的微生物的种类和数量不同人体血液性质或其他体液的环境的差异血液流速及动力学因素插管装置建立和使用时间的长短体内研究阿奇霉素对生物被膜形成的影响亚 MIC 大环内酯类抗生素对生物膜的影响已有研究表明， 亚 MIC 浓度的红霉素、罗红霉素、阿奇霉素及克拉霉素等大环内酯类药物

29、对革兰阴性菌尤其是铜绿假单胞菌生物膜形成抑制效果最强， 亚 MIC 浓度的大环内酯类药物是目前已知的抑制铜绿假单胞菌生物膜形成效果最好的抗生素， 其中红霉素、罗红霉素、阿奇霉素及克拉霉素等药物均在体外实验证明其能明显抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成。阿奇霉素对生物被膜形成的影响亚 MIC 大环内酯类抗生素对生物膜的影响细菌生物膜的形成还可受 QS 系统的调节。阻断 QS 系统激活可有效抑制细菌生物膜的形成。有研究显示， 对于铜绿假单胞菌 QS 系统， 以阿奇霉素为代表的大环内酯药物可以通过下调该 QS 系统的 rhlI 基因和lasI 基因的表达， 并抑制其产物自体诱导分子 3-oxo-C12-H

30、SL 与 C4-HSL 的生成， 从而阻断铜绿假单胞菌 QS 系统激活， 抑制生物膜形成。FAVE-BONTE S， KOHLE T， VAN DELDEN C Biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa: ole of the C4-HSL cellto-cell signal and inhibition by azithromycin J J Antimicrob Chemother， 2003， 52( 4) : 598-604 TATEDA K， COMTE ， PECHEE JC， et al Azithromycin inhibits

31、quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa J J Antimicrob Chemother， 2001， 45( 6) : 1930-1933阿奇霉素对生物被膜形成的影响亚 MIC 大环内酯类抗生素对生物膜的影响联用亚MIC大环内酯类药物可增强部分抗生素的杀菌或抑菌活性。如阿奇霉素、克拉霉素和红霉素等大环内酯类抗生素可提高头孢他啶和亚胺培南等抗生素对铜绿假单胞生物膜菌的杀菌活性，其机制可能与亚MIC浓度大环内酯类抗生素影响铜绿假单胞菌生物膜完整性的形成有关。临 床 将 常 规 剂 量(400mg/d) 的克拉霉素与低剂量(500mg/d) 的亚胺培南 /西司他丁联合应用于铜绿假单胞菌与表皮葡萄球菌混合的尿路生物膜感染， 取得了治愈效果。Combined effect of clarithromycin and im