植物组织与细胞培养定义和过程

1、植物组织与细胞培养定义和过程一、 植物组织培养定义是指在无菌的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、胚胎、原生质体等培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤，长成新的完整植株的一种实验术。1、探索阶段（20世纪初至20世纪30年代）1902年，德国植物学家哈伯兰德（Haberlanclt）就预言，植物细胞具有全能性，即高等植物的器官和组织可以不断分割，直至分到单个细胞的观点，并设想离体植物活细胞具有能够发育成为完整植株的潜在能力。 而且进行了相关实验：培养植物叶片细胞。因此，被称为 植物组织培养的father二 、发展历史2、奠基阶段（20世纪30年代中至50年代未）两个重要

2、发现：1、认识了B族维生素对植物生长的重要意义； 2、发现了生长素是一种天然的生长调节物质。1933年我国的李继侗和沈同研究银杏的胚培养，将银杏胚乳提取物加入培养基，获得成功。1934年Went 发现了生长素。随后相继发现了吲哚丁酸、萘乙酸和2，4-D等。B簇维生素。1934年，美国的White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性系，使根的培养首次获得了真正的成功。（培养基：无机盐、酵母提取物和蔗糖，后来用3种B族维生素：吡哆醇、硫胺素和烟酸取代酵母浸提物获得成功）1934年Gautheret在山毛柳和黑杨等形成层组织的培养中发现培养基中加了B族维生素和IAA后，形成层的生长明显增加，揭示了B族

3、维生素和IAA在植物组织培养中的作用，直接导致了1939连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。1939年Nobecourt的胡萝卜也建立了连续生长的培养物。 故三人被誉为植物组织培养的奠基人。1943年,white 正式提出了植物细胞具有全能性的学说.1948年，Skoog和催澄在烟草茎段和髓培养以及器官形成的研究中发现，腺嘌呤或腺苷可以解除生长素（IAA）对芽形成的抑制作用，而诱导形成芽，从而确定了腺嘌呤/生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。1956年，Miller发现了激动素后，用它代腺嘌呤的效果更好。1958年，在美国工作的英国人Stewward，从胡萝卜愈伤组织和细胞培养中，诱导

4、分化产生了个体植株，给“全能性”理论以科学论证。3、迅速发展阶段（20世纪60年代至现在）1960年，Cocking用真菌纤维素酶在番茄幼根分离得到大量活性原生质体，开创了植物原生质体和体细胞杂交研究工作。Kanta在植物试管受精研究中首次获得成功。1960年，Morel用兰花茎尖培养实现了脱去病毒和快速繁殖方面已获成功，导致欧洲、美洲和东南亚等许多国家兰花工业的兴起。（茎尖-原球茎-小植株）1962年Murashige和Skoog发表了促进烟草组织快速生长的培养基组成，这就是目前我们常用的MS培养基。1964-1966年，印度的Guha和Maheshwari成功地在毛叶曼佗罗花药培养中由花粉

5、诱导得到了单倍体植株。1970年Power首次成功实现原生质体融合。1971年Takebe等首次由烟草原生质体获得再生植株，这一成功促进了体细胞杂交技术发展，同时也为外源基因导入提供了理想的受体材料。1972年，Carlson等通过原生质体事例首次获得了两个烟草物种的体细胞杂交种。1978年Murashige提出了人工种子的概念。20世纪80年代初，随着土壤农杆菌成功的用于植物遗传转化，植物基因工程开始成为研究的热点。1983年Zambryski首次用农杆菌转化烟草，获得首例转基因植物。 三、特点1.培养条件可人为控制2.生长周期短繁殖率高3.管理方便，利于自动化4.遗传品质一致5.培养材料经

6、济6.误差小、重复性强四、意义和应用（1）能够有效保持优良品种特性（2）获得无病毒植株（3）快速繁殖新品种，加速优良品种推广（4）节约耕地，提高农民产品产出率（5）在遗传、生理生化和病理等研究上的应用（6）便于运输与种质资源保存五 、 实验室、设备要求和实验室设计 植物组织培养是在无菌的条件下进行离体植物材料培养的技术。要达到无菌操作和无菌培养，首先是要有一定的无菌环境，使用无菌的容器和用具（经过灭菌处理的）进行无菌操作，将无菌的植物材料接种在无菌的培养基上，然后把要培养的植物材料放在一定的温度、湿度、光照、营养条件下，使其生长、发育和繁殖，这就必须要有一定的设备和条件。51 植物组织培养室的

7、基本结构 选址： 在建造植物组织培养室时，应选择采光好、通风好、环境干净的地点，以利于组织培养的顺利进行和降低培养过程的污染率。 实验室：植物组织培养工作的开展除需要培养室外，还应该有与之配套的洗涤室、药品室、称量室、培养基配制室、灭菌室、接种室、培养室、细胞学实验室、暗室和物品存放室等。 （1）洗涤室洗涤培养容器、小用具等，要求有工作台面、上水和下水，水池、培养容器摆放支架、电源、电热干燥箱等。洗涤室墙壁要有耐湿、防潮功能。新购进的玻璃器皿首先要用1%左右浓度的稀盐酸将可溶性无机物除去，再用中性洗涤剂洗涤，一般器皿的洗涤可用洗衣粉洗涤，或用洗衣粉加热洗涤，用自来水冲洗干净。对较难洗涤的培养容

8、器，如吸管等可在重铬酸钾洗液中浸泡后再洗，洗到玻璃表面上不沾水滴才算合乎要求。（2）药品贮藏室 要求干燥、通风，避免光照，有存放各种药品试剂的药品柜、冰箱等设备，化学试剂、玻璃器皿等物品分类存放于柜中，有毒物品（HgCl2）需要专人密封保存，需低温保存的药品和药液放置于冰箱中贮藏，药品贮藏室紧邻化学称量室较好，便于工作。（3）称量室（天平室） 要求干燥、密闭，无直射光照，避免腐蚀性药品和水气直接接触。有固定的水磨石平台，安放普通天平和万分之一分析天平（电子天平），要有电源插座，最好设计在阴面的房间，这样对怕光药品的保存和称量有利，称量室紧邻培养基配制室较好，以方便配制母液和培养基。如房间较少时

9、，可以与药品储藏室合二为一。（4）培养基配制室主要进行培养基的配制、分装和灭菌前的暂时存放。配制的培养基需要实验台，上下水，电源，加热设备等。配制培养基室要求备有各种试管、三角瓶、烧杯、量筒、吸管等玻璃器皿，有安放药品和器皿的各种橱架、水浴锅、过滤灭菌装置和酸度计等。规模较小时， 可与洗涤室合并在一起。（5）培养基灭菌室器皿和培养基的消毒灭菌，最好在一个专用的灭菌室内进行。由于采用高温高压蒸汽灭菌方法，灭菌室最好有排除蒸汽的排风扇等。建筑上要求其墙壁耐湿、耐高温。有用于干热灭菌的烘箱、湿热灭菌的高压蒸汽灭菌锅、蒸馏水器、水源、水池，供、排水设施。有用于灭菌的两相和三相电源或煤气加热装置，摆放和

10、存放器皿和培养基的架子和橱柜。规模小时，可与洗涤室和配培养基室合并。（6）培养基存放室灭菌的培养基最好存放一段时间后进行接种工作，以防污染和损失苗木。规模小时，可与洗涤室、配培养基室和灭菌室合并。（7）过度室（缓冲室）为避免进出时带进杂菌，无菌室外应该设置预备室，作为缓冲间。预备室和无菌室之间最好用玻璃墙隔离，便于观察和参观。在预备室中可放置工作服、鞋、帽等，也需要安装自来水、水池和紫外灯，用于接种前的洗手和紫外灭菌，电源开关最好安装在预备室外边，以免在开关灯时紫外线对眼睛和皮肤造成伤害。（8）接种室无菌室的好坏对组织培养成功与否起重要作用。无菌操作室主要进行繁殖材料的表面灭菌和试管苗的继代培

11、养和材料转接，要求室内干净、密闭，光线好。一般安装滑动门，以免造成空气流动，引起污染。室内墙壁光滑平整，地面平坦无缝，便于清洁工作。应该安装紫外灯，以便照射灭菌，还要有照明装置及插座,以备临时增加设备之用。室内有超净工作台、接种用的小推车以及试管、三角瓶、塘瓷盘、酒精灯、接种工具等。平房易吸潮，容易引起污染，因此有条件的设计应选择楼房，最好在二层或二层以上，与其他区域隔离。为保证无菌室的良好条件，可预先用福尔马林熏蒸，工作台用70%酒精药棉擦拭，在开紫外灯灭菌前应该把所有需要的物品放入。不要造成死角，以免紫外灯无法照射到。此外还应该设有消防设施。21 （9）培养室培养室是培养材料进行培养和生长

12、的场所，培养室的大小应根据培养架的数量和生产规模而定。植物组织培养需要较长的培养时间，同时还须考虑温度和光照的影响。通常培养室的温度保持在适宜一般植物生长的范围内，多为2027 ，光照强度在1000 lx以上。一般光照强度1000-5000 Lx，每天光照时间816 h。 培养室应设计成多个小培养间比一个大房间效果好，因为小的培养间容易控制温度、光照等环境指标，特别是培养材料较少时节能效果更为明显。培养多种植物时的优点更为突出，如不同植物所需的培养温度、光周期不同，所设定的培养温度和光周期不可能适合培养的每一种植物。小培养间也可以减少污染，培养室容易消毒和保持清洁。至少设计成一大一小两间培养室

13、，这样可以防止万一环境污染，不至于全军覆没；也可以用大的培养间大量繁殖苗木，小的用来科研及少量珍稀品种试验；当不同培养材料需要不同的培养条件时，便于分别处理。（10）细胞学实验室 为观察、记录培养材料的生长情况及实验结果，需要有细胞学实验室。细胞学实验室应有固定的水磨石台面，放置显微镜、解剖镜等仪器。室内应安静、干净、清洁、明亮，保证光学仪器不振动、不受潮、不污染。室内还应该有一套染色设备，因为有时为了观察清楚需要染色或进行制片观察。（11）暗室 试验材料的摄影记录，一般可以用装有照相装置的显微镜、解剖镜进行，有时需要用照相机直接拍摄完整材料。进行拍摄后需要冲卷和洗相，这就必须有配套的暗室，以

14、便及时看到结果。在暗室应有冲洗、印相、放大、上光等设备。有固定的水泥工作台面，还要有电源和自来水装置。（12）物品存放室暂时不用的器皿、用具等贮存在物品存放室内。物品存放室应当设计在背阳、通风的房间，室温较低，一般用楼房的低层的阴面房间较好，便于搬运。（13）温室（大棚） 试管苗移栽必须在温室或塑料大棚内进行。试管苗移栽时一般要求温室最低温度在15 以上，相对空气湿度在70%以上。52组织培养常用仪器设备及要求（1）玻璃器皿植物组织培养工作对玻璃器皿的需要是灵活多样的，多种器皿都可使用。玻璃器皿最好用硼硅酸盐（即派热克斯玻璃）材料制造，一般要求溶解度小，其形状可根据研究工作的目的和要求而定。（

15、A） 培养容器培养用的玻璃器皿要求透光度好，能耐高压蒸汽灭菌。根据培养目的和要求不同，可采用不同种类和规格的玻璃器皿。试管 在需要少量培养基进行研究、接种外植体或进行幼胚培养（如桃幼胚等）的实验中，可以选用试管进行培养。要求试管口径要大、长度稍短，便于操作，以2.0cm15cm、2.5cm15cm、3.0cm15cm为宜。三角瓶 又叫三角烧瓶和锥形瓶，具有瓶口小，瓶底大，培养面积大，受光好，易放置，培养效果好，在植物组织培养中最常用。接种外植体时多用容积为50mL的三角瓶，一般实验用100mL的三角瓶，生产育苗多用150mL的三角瓶。近年来，三角瓶在组织培养中的应用愈来愈广泛，无论是固体培养还

16、是液体培养，都可用三角瓶。一般用口径2.5cm3cm的大口径三角瓶较好。果酱瓶或罐头瓶 成本低，瓶口大，操作方便，透光好，培养材料生长健壮，但培养污染率较高。生产中应用较多的是200mL的果酱瓶，也有用较大的罐头瓶。培养皿 在无菌材料分离、滤纸灭菌、种子发芽、病毒鉴定时较常用，其规格有直径6cm、9cm、12cm的。固体平板培养一般采用直径6cm的小型培养皿。此外，可以用培养皿室内催芽，以供培养时取材之用。在无菌室还可以在培养皿中解剖茎尖、分离花粉、切割继代培养物及其他外植体或培养材料。植物组织培养专用容器 这是一种新型组培专用容器，采用进口高分子PC（俗称太空玻璃）为主要材料生产，在高压蒸汽

17、灭菌条件下反复使用不破裂、不变形，使用寿命长，透光率高于玻璃容器。最大的优点是不易破碎，符合机械化洗瓶要求，利于降低损耗和工厂化生产。瓶口包扎，以达到防止培养基干燥和杜绝污染的目的。可用多种方法，通常以纱布包被棉花塞，外边再包一层牛皮纸，用线绳或橡皮筋捆扎，也可用封口膜、铝箔、双层硫酸纸、耐高温的塑料纸、耐高温的塑料盖。（B） 盛装器皿盛装容器主要是存放各种试剂和药液。磨口瓶 包括无色和棕色两类，细分为广口瓶、细口瓶，规格有1000mL、500mL、250mL、125mL，广口瓶用于存放试剂，细口瓶用来分装配制好的各种母液。不易保存的母液存于冰箱中低温保存，见光易分解的药品可用棕色瓶安全保存。

18、 滴瓶 盛装一定浓度的酸液或碱液，用于调节培养基的pH值。其中碱液用塑料滴瓶更好。搪瓷锅（盆）或不锈钢锅（盆） 用于配制和熬制培养基，研究可用较小的规格，如1000mL规格的搪瓷缸，或4000mL规格的搪瓷锅，生产上要选较大的规格，如8000mL或更大规格的不锈钢锅较好，可提高劳动效率。烧杯 规格有1000mL、500mL、250mL、125mL、50mL，用于配制各种母液和培养基。（C） 计量器皿计量器皿要求有准确的刻度，以便于在配制各种母液及培养基时能准确定量，减少实验误差。容量瓶 规格有1000mL、500mL、250mL、125mL、50mL，用于配制各种母液时定容。刻度吸管 又叫移液

19、管，规格有10mL、5mL、1mL、。用于吸取各种母液。量筒 规格有1000mL、500mL、250mL、100mL、50mL、25mL 、10mL、5mL，用于配制不同浓度的酒精和配制培养基时吸取大量元素母液等。（D）其他 除以上各种容器外，还应具备一些其他玻璃器皿，如漏斗、称量瓶、玻璃棒等，以便用于培养基的制备等工作。有条件时，还可以配备培养基分装器，由大型滴管、漏斗、橡皮管及铁夹等构成。此外，还有量筒式分装器，上有刻度，下有橡皮管及铁夹控制。微量分装可用注射器。（2）仪器与设备天平 可以根据实际需要配备选择如下称量仪器。天平应放在干燥，避免震动，无腐蚀性药品的地方，应尽量避免移动，天平匣

20、内应放硅胶或其他中性干燥剂以保持干燥。（A） 药物天平称量精度为，用来称取蔗糖和琼脂等。（B） 扭力天平 既移动方便，又较为灵敏的称量仪器，可弥补药物天平和分析天平各自的不足，精度为，而且在1g 内的物品不用加砝码，故使用方便。（C） 分析天平 精度为，用来称取微量元素和植物生长调节物质及微量附加物。选择平稳，干燥，没有腐蚀性药品和水气的地方放置天平。（D） 电子天平 精度高、称量快、但价格较高。冰箱 分普通冰箱和低温冰箱。某些试剂、药品和母液需低温保存；有些材料需低温处理。一般备有家庭用冰箱即可。烘箱和恒温箱 洗净后的玻璃器皿，如需迅速干燥，可放在烘箱内烘干，温度以80100为宜。若需要干热

21、灭菌，温度升高至150180，持续13h即可。在进行培养物的干重分析时，可在80条件下烘干。恒温箱即可用于植物原生质体和酶制剂的保温，也可用于组织培养中暗培养。恒温箱内装上日光灯可进行温度及光照方面的小型实验。显微镜 一般用双目体视显微镜较多，用于剥取茎尖以及隔瓶观察内部植物组织生长情况。同时也还要有生物显微镜，用以观察花粉发育时期及培养过程中细胞核的变化等。此外，倒置显微镜可以从培养器皿的底部观察培养物，因此，在液体培养时，可用倒置显微镜进行观察。酸度计（pH试纸也可） 培养基中的pH值十分重要，因此，在配制培养基时，需要用酸度计测定和调整。一般用小型酸度测定仪，既可在配制培养基时使用，也可

22、测定培养过程中pH值的变化。若不做研究，仅用于生产，也可用精密pH47的试纸来代替。测定培养基pH值时，应注意搅拌均匀后再测。蒸馏水器 水中常含有无机和有机杂质，如不除去，势必影响培养效果。植物组织培养中常使用蒸馏水或去离子水，蒸馏水可用金属蒸馏水器大批制备，要求更高的用硬质玻璃蒸馏水器制备。去离子水是用离子交换器制备的，成本低，但不能除去水中有机成分。一般生产性的组培育苗，对水要求不太高，除配制各种母液用蒸馏水或去离子水外，配制培养基所用水可以用自来水代替，如果当地水质较硬，可以用煮沸过并沉淀去杂质后的白开水，以降低生产成本。空调器（空气调节器） 夏季高温不利于试管苗生长繁殖，常常造成组培苗

23、生长不良，或引起玻璃化等不良反应，需要购置空调器降温，空调器功率应根据培养室大小来定。超净工作台 如有条件购置先进设备超净工作台，既方便，又舒适，无菌效果又好，它可代替无菌室和接种箱。超净工作台原系工业用于半导体元件与精密仪器仪表的装置，现已成为植物组织培养上最常用、最普及的无菌操作装置。它有单人、双人、及三人式的，也有开放和密封式的。超净工作台一般较宽，购置和设计房屋时应注意，以防房门太窄而搬不进去。超净工作台主要是通过风机，将送入的空气经过细菌过滤装置，再流过工作台面。因此超净工作台应放置在空气干净、地面无灰尘的地方，以延长使用期。使用过久，引起堵塞，需要清洗和更换过滤器。培养架 进行固体

24、培养和试管苗大量繁殖时，需要有放置培养瓶的培养架。制作培养架时应考虑使用方便、节能、充分利用空间以及安全可靠。架子可用金属、木材制作，隔板可用玻璃、木板、纤维板、金属板等，最好用平板玻璃或铁丝网，既透光，上层培养物又不受热。这里介绍一种效果好、容量大、使用较安全、较适用的培养架，立柱用直径30 mm左右的钢管，横架用25 mm角钢焊制而成，灯座装于每层两侧的横架上，其上有槽，用于固定灯座。每层装40 W日光灯23个，镇流器最好装于室外以利于散热。也可在两端横架下方68 cm另装一横档，其上装灯座和启动器。还有一种叫为万能角铁的配件，其长度为3 m，可切割成不同长度的配件，用于组装培养架。此种培

25、养架可以任意组装，并且造价较低。1根万能角铁原料售价一般在20元人民币，1个培养架用10 根，加上螺丝等小型配件，1个培养架造价在300元以内，较由其他的原料制成的培养架成本低。木制和铝制造价和铁制的造价均在500元以上，并且显得笨重，特别是木制的容易发生火灾。灭菌装置 高压蒸汽灭菌锅是最基本的设备，用于培养基、器械等的灭菌。有大型卧式、中型立式和小型手提式等多种，可按生产规模来选用，大型效率高、小型方便灵活。小型手提式有内热式和外热式两种，内热式加热管在锅内，省时省电，但不能用火炉加热；外热式可用电炉、煤炉、煤气等加热。手提式内热小型高压灭菌锅配一个3 kw调压变压器和定时钟，可实现半自动灭

26、菌，并省电40%。此外，应有紫外线灯、水浴锅、室内小推车、振荡培养机和旋转培养机及其他培养装置。（3）用具和器械 组织培养所需要的用具和器械，可选用医疗器械和微生物实验所用的器具。常用的用具和设备如下。镊子 小型尖头镊子，适用于摄取植物组织和分离茎尖、叶片表皮等。长1625cm的枪形镊子，腰部弯曲，使用方便，可用于接种和转移植物材料。剪刀 常用的有解剖剪和弯头手术剪，一般用于试管内剪取茎段，进行继代培养的转接。在剪取外植体时，特别是木质化程度较高的枝条常用剪枝剪（修枝剪），在果树组织培养中，枝条修整时也需要修枝剪。解剖刀和芽接刀 常用的解剖刀，有长柄和短柄两种。刀头也有双面和单面之分，可以经常

27、更换。对大型材料如块茎、块根等需用大型解剖刀。果树的枝芽常需要芽接刀。接种工具 包括接种针、接种钩及接种铲，由白金丝或镍丝制成，用来接种花药或转移植物组织。钻孔器 取肉质茎、块茎、肉质根内部的组织时使用。钻孔器一般做成T形，口径有各种规格。细菌过滤器 溶液中有些生长调节物质以及有机附加物质，如吲哚乙酸等，在高温条件下易被分解破坏，可用细菌过滤器来除菌。可采用金属制的蔡氏漏斗，以石棉微孔滤膜（孔径为m）除去细菌。在过滤较少量的液体时，宜用醋酸纤维素或硝酸纤维素物质制成的微孔滤膜，其孔径为m。这种滤膜在氧气存在下，能经受125高温灭菌。在过滤灭菌时需要一套加压（注射器）或减压吸滤设备，漏斗下接吸滤

28、瓶，吸嘴处接上一只内装脱脂棉的滤气玻璃管。 注射器 普通的皮下注射器头上安装滤板夹，其上有m滤板，构成一个微孔滤板微量注射器。可用来过滤灭菌，也可以用于微量悬滴培养中的营养液的分装。其他 灼烧工具用的酒精灯、用于溶解培养基的带有磁搅拌器的电炉、用于加速溶解大量琼脂培养基的微波炉、用于贮备无离子水和重蒸馏水的大型塑料桶、试管架以及转移培养瓶、试管架的搪瓷盘或小铁篮等。另外，可以根据培养效果的好坏和成本的高低选用适当的瓶塞和外罩。一般试管和烧瓶可用未经脱脂的棉花塞（有时包上纱布或粗布），亦可用泡沫塞子或铝箔塞。铝箔也用以包裹棉塞和泡沫塞，也可以用能经受高压灭菌的塑料盖。近年来，有一种透明的、可进行

29、高压消毒的封口薄膜，既防止污染，又可使空气透过，并有良好的透光作用。预先灭菌的或经过高温灭菌的培养器皿也可用帕拉胶片（parafilm）密封，该胶片是一种蜡制的、不能进行高温灭菌、可伸展的黏性薄片或胶带。也有只用两三张羊皮纸或其他纸来包扎瓶口。六 培养基的配制、灭菌及操作技术植物组织培养成功与否，一方面取决于培养材料本身的性质,另一方面取决于培养基的种类和成分，所以组织培养的发展与培养基的改进是分不开的。不同的植物材料对培养基的要求不同，因而必须根据不同的植物材料以及不同的培养目的选择合适的培养基，并按照不同的培养阶段加入适当的添加物。作为主要碳源的蔗糖、支撑物琼脂的浓度及培养基的pH值都会影

30、响外植体和培养材料的生长和发育。培养基通常有两个水平（或两个组成部分）一、是基本培养基，包括大量元素和微量元素（无机盐类），维生素和氨基酸，还有糖和水等。迄今为止，基本培养基已有几百种，但较常用的仅一二十种，如MS、改良MS、White、Nitsch、N6、B5等基本培养基。二、是完全培养基，即在基本培养基的基础上，根据各种不同试验要求，附加一些物质，如添加各种植物生长调节物质（BA、ZT、KT、2IP、2,4-D、NAA、IAA、IBA、GA等）以及其他的复杂有机附加物，包括有些成分尚不完全清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、番茄汁、酵母提取物、麦芽膏等。61 培养基的营养及成分（2）无机盐无

31、机盐是植物生长发育所必需的化学元素。在植物组织培养时，各种营养物质主要从培养基中获得，如氧、氢元素从水中得到，矿质元素要靠加入适宜的无机盐类物质提供。培养基中除了氧、氢、碳有机物外，剩下的为矿质元素，包括N、P、K、S、Ca、Mg等大量元素和Fe、Mn、Zn、Cu、B、Mo等微量元素。 （1）水大量元素 大量元素常占植物体干重的百分之几至万分之几氮是最重要的。一般用硝态氮或氨态氮。即无机氮在培养基中有两种供应形式，一种是硝酸盐；另一种是氨盐。当作为唯一的氮源时，硝酸盐的作用要比氨盐好得多，但在单独使用硝酸盐时，培养基的pH值会向碱性方向漂移。若在硝酸盐中加入少量氨盐，则会阻止这种漂移。因此，培

32、养基既含有硝酸盐又含有氨盐为好。磷对植物的生命活动具有十分重要的作用，缺磷时蛋白质合成降低。钾、钙、镁、硫等元素能影响植物组织中酶的活性，决定着新陈代谢的过程。微量元素 主要包括Fe、Mn、Zn、Cu、B、Mo、Co多种微量元素，用量10-510-7mol/L，植物对这些元素的需要量甚微，稍多即会发生外植体变性、酶失活、代谢障碍等毒害。微量元素对植物组织的生命活动都有重要作用。如硼促进生殖器官的发育,影响蛋白质的合成和授粉受精；铜有促进离体根生长的作用；锰与呼吸作用和光合作用有关。锌是各种酶的构成要素，增强光合作用效率，参与生长素代谢。Fe盐 对叶绿素的合成与延长生长起重要作用。铁元素不易被植

33、物直接利用和吸收，通常以硫酸亚铁和Na2-EDTA(螯合剂)配制成螯合物用于培养基中。早期配方中曾采用过硫酸铁Fe2(SO4)3，后又用氯化铁（FeCl2）代替硫酸铁，但它们都不是理想的铁供应源。在根培养时，接种后一周，采用氯化铁的培养基的pH值就由偏移到，根开始表现出缺铁症。与根不同，愈伤组织由于能分泌与铁离子相结合的天然螯合物，可以在一定程度上利用铁盐。（3）有机化合物 主要包括碳源（也是能源）、维生素类、氨基酸及其他有机附加物。碳源 植物组织在离体之后，由于没有叶绿体或只有发育不好的叶绿体，基本上不能制造需要的碳水化合物，难以依靠自养作用维持其生存，必须在培养基中另外加入碳水化合物，它所

34、需要的碳素是以各种糖的形式提供于培养基中。糖除了在培养基提供培养物所需的碳骨架和能源外，还可在一定程度上调节培养基的渗透压。碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以糖类物质最为重要。一般来说，蔗糖是最好的糖源，它具有热易变（heat-liable）的性质，经高压灭菌后，大部分分解为D-葡萄糖、D-果糖，只剩下部分的蔗糖，这更有利于吸收和利用。此外也可以直接利用果糖、葡萄糖、麦芽糖、纤维二糖等。也有利用多糖类的可溶性淀粉和糊精以及果胶的报道。 常用的糖浓度为15%。糖的浓度不只是对细胞增殖有作用，同时也是影响细胞分化的因素之一。 维生素类 主要以各种辅酶的形式多项代谢活动，对生长分化有一定的作

35、用。完整植株是能够制造维生素的，但是离体组织却不能合成足够的维生素。常用的维生素浓度约之间。其中盐酸硫胺素（维生素B1）是绝对需要的（全面促进植物生长），一般加烟酸（维生素B3）、盐酸吡哆醇（维生素B6）对根的生长好处。维生素热易变性，易在高温下降解，可进行过滤灭菌，添加肌醇能改善培养植物的生长状况，在培养基中加入1.0 mg/L的肌醇就足以影响维生素B1的效应。加泛酸钙（维生素B5）、生物素（维生素H）以及抗坏血酸（维生素C），但它们并不是普遍的限制因子。氨基酸是蛋白质的组成成分，也是一种有机氮源，除构成生物大分子（如蛋白质、酶等）的基本组成外，还具有缓冲作用和调节培养物体内平衡的功能，对外

36、植体的芽、根、胚状体的生长、分化有良好的促进作用。常用的氨基酸有甘氨酸、酰胺类物质（如谷酰胺、天门冬酰胺）和多种氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白）等。此外还有谷氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、精氨酸以及酪氨酸等。 天然复合物 天然复合物的成分比较复杂，大多数含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。由于其对一些难培养的培养材料有特殊作用，所以在一些试验中还常常应用它。常用的天然复合物有椰乳（CM，100-200mL/L）、玉米胚乳、香蕉汁（150-200mL/L）、马铃薯汁（100-200mL/L）、 、水解酪蛋白(CH)、水解乳蛋白（LH）、酵母提取液（YE，0.5%）、麦芽浸出物（ME）、苹果汁

37、等。由于它们是天然有机物，其成分往往不一，这些差异将会影响实验的重复性。植物生长调节物质 是培养基中不可缺少的关键物质，虽然用量少，但对外植体愈伤组织诱导和根芽等器官分化，起着重要和明显的调节作用。影响最显著的植物生长调节物质主要是生长素类和细胞分裂素类物质。生长素类：促进细胞的伸长生长和细胞分裂，被用于诱导愈伤形成，促进生根。生长素类中的吲哚乙酸（IAA）由于比较容易被氧化而很少使用，常用的是二氯苯氧乙酸（2,4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚-3-丁酸（IBA）。诱导愈伤组织用2,4-D、NAA，用量：细胞分裂素类:可促进植物细胞的分裂和不定芽形成，打破顶端优势形成丛生芽，有利于芽的增殖，常

38、用于继代和增殖培养。激动素(KT)、异戊烯基腺嘌呤（2iP）、6-苄基腺嘌呤（BAP）、玉米素（Zt）、噻重氮苯基脲（TDZ），强弱依次为： TDZ Zt 2iP BAP KT 。其它类:赤霉素GA3、脱落酸ABA、多效唑PP333（4）培养材料的支持物为使培养材料在培养基上固定和生长，要外加一些支持物。琼脂（agar）是使用最为普遍的凝固剂，本身并不提供营养，它是一种高分子的碳水化合物，从海藻中提取，仅溶于95左右的热水，成为溶胶。通常的用量为0.5-1.0%。加的太多，则培养基过硬；用量太少，则培养基太软，培养基酸度大或灭菌时间过长时，培养基也发软。琼脂的质量和纯度不仅对培养基的硬度有影响

39、，而且还会影响培养结果，固体培养基所需要设备简单，使用方便，只须可供调控温度及光照的培养室。但固体培养基只有部分材料表面与培养基接触，不能充分利用培养容器中的养分，而且培养物生长过程中，排出的有害物质的积累，而造成自我毒害，必须及时转移。液体培养基需要转床、摇床之类的设备，通过振荡培养，给培养物提供良好的通气条件，有利于外植体的生长，避免上述固体培养基的缺点。 （5） 培养基的pH值培养基的pH值因培养材料不同而异。大多数园艺植物都要求在的条件下进行组织培养。培养基的pH值的变化会影响到一些离子的溶解度，会使一些溶解度变小的盐类沉淀，影响到植物对各元素的吸收比例，甚至会出现缺素症。琼脂培养基的

40、pH值还会影响培养基的凝固情况，一般培养基偏酸时（低于），培养基凝固较差，需要较多的琼脂才能凝固，反之，培养基偏碱时（高于），凝固效果好。经高压灭菌后pH值会稍有下降,一般用1mol/L HCl调低.用1mol/L NaOH调高.（6） 其它成分在培养基中往往因培养目的不同、植物材料不同，而加入一些其它成分。目前较常见的有活性炭，另外还有抗生素物质、抗氧化剂、诱变剂、生长抑制剂等。63 培养基母液的配制每种培养基往往需要十多种化合物，配制起来很不方便，也很难达到准确和精确，特别是微量元素和植物生长调节物质用量极少，很难准确秤量，为了简便起见，将配方中的药品一次称量供一段时间使用，即配成一些浓缩

41、液，用时稀释，这种浓缩液就是浓缩贮备液（简称母液）。如果采用配制母液的方法，不仅可以解决上述问题，而且还可以减少工作量和便于母液的低温贮藏。母液浓缩液是根据培养基配方加大若干倍（一般多为10200倍），一般按试剂种类和性质将其分别秤量，分别溶解，分别配制，单独保存或几种混合保存。几种试剂混合配制时要按一定顺序将各种溶液混合成一定倍数的母液，母液浓度为实际应用时浓度的10200倍，配制培养基时再按比例吸取即可。这样配制一次母液，可多次使用，并在配制较多数量的培养基时，降低工作强度，提高工作效率，也提高试验精度。常用的配制母液的方法是将大量元素分别称量后，分别溶解后配成大量元素母液，微量元素按统一

42、的扩大倍数分别称量和溶解在一起配制成微量元素母液，铁盐、有机物均需单独配制，在配制母液时应注意防止产生沉淀。药品应采用纯度等级较高的分析纯AR（二级）或化学纯（三级），以免带入杂质和有害物质对培养材料有不利影响。配制母液要用纯度较高的蒸馏水或去离子水，药品称量、定容都要准确。配好后，在容器上贴上标签，注明配制日期、母液倍数和名称。应置于24冰箱中保存，尤其是生长调节物质与有机物更应如此。基本培养基的四种母液有：大量元素（浓缩20倍）；微量元素（浓缩200倍）；铁盐（浓缩200倍）；除蔗糖之外的有机物质（浓缩200倍）。在制备这四种贮备液时，应使每一种成分分别溶解，然后再把它们彼此混合。现以MS

43、培养基为例进行母液的配制。 （1）大量元素母液在配制大量元素母液时一定要分别称量，分别溶解，在定容时按表中的序号依次加入容量瓶中，以防出现沉淀。倒入贮液瓶中，贴好标签和标好记录后，可常温保存或放入冰箱内保存。 大量元素母液（配1升20倍的母液） 序号 成分 配方用量(mg/L) 称取量（mg） 1 NH4NO3 1650 33000 2 KNO3 1900 38000 3 KH2PO4 170 3400 4 MgSO47H2O 370 7400 5 CaCl22H2O 440 8800配1升培养基吸取量50mL（2）微量元素母液在配制微量元素母液时也应分别称量和分别溶解，可用蒸馏水，也可用去离

44、子水，定容时不分先后次序，可随意加入容量瓶中定容，一般不会出现沉淀现象。倒入贮液瓶中，贴好标签和标好记录后，可常温保存或放入冰箱内保存。微量元素母液（配1升200倍的母液） 成分 配方用量(mg/L) 称取量 （mg） MnSO44H2O 22.3 4460 ZnSO47H2O 8.6 1720H3BO3 6.2 1240KI 0.83 166 Na2MoO42H2O 0.25 50 CoCl26H2O 0.025 5 CuSO45H2O 0.025 5 配1升培养基吸取量5(mL)（3）铁盐母液由于铁盐无机化合物不易被植物吸收利用，只有其螯合物才容易被植物吸收和利用，因此需要单独配成螯合物母

45、液。目前常用的铁盐为硫酸亚铁（FeSO4.7H2O）和乙二胺四乙酸二钠的螯合物。此螯合物使用方便，又比较稳定，不易产生沉淀。配制方法为：称取克硫酸亚铁和克乙二胺四乙酸二钠，分别用450mL的离子水（或蒸馏水）溶解，分别适当加热并不停搅拌，待分别溶解后，再将两种溶液混合在一起，调整pH值到，最后加蒸馏水或去离子水定容于1000mL的容量瓶中，倒入棕色贮液瓶中，贴好标签和标好记录后放入冰箱内保存。铁盐母液（配1升200倍的母液） 成分 配方用量(mg/L) 称取量（mg） FeSO47H2O 27.8 5560 Na2-EDTA 37.3 7460 配1升培养基吸取量5(mL)（4）有机物母液按表

46、中用量分别称取各种有机物，分别溶解后，用蒸馏水或去离子水定容于1000 mL的容量瓶中，放入细口瓶中备用，贴好标签和标好记录后置于冰箱中低温保存。琼脂、蔗糖等用量较大的有机物质，不用配成母液，在配制培养基时按量直接称取，随取随用。 有机物母液（配1升200倍的母液）成分 配方用量(mg/L) 称取量（mg）肌醇 100.0 20 000 烟酸（VB5） 0.5 100 烟酸硫胺素（VB1） 0.1 20 盐酸吡哆醇（VB6） 0.5 100 甘氨酸 2.0 400 配1升培养基吸取量5 (mL)（5）生长调节物质母液绝大多数生长调节物质不溶于水，可以加热并不断搅拌促使溶解，必要时加入稀酸或稀碱

47、等物质促溶。各类植物生长调节物质的用量极微，通常使用的浓度单位是mg/L，一般也要配制成母液，母液配制成1mg/mL的浓度，即称取100mg生长调节物质，溶解后用容量瓶定容至100mL。有些药品配制母液时不溶于水，需要用稀酸、稀碱或酒精溶解。常用的生长调节物质和有机物的溶解方法如下：（A） 生长素类 溶于95%的乙醇或的NaOH中，用去离子水或蒸馏水定容，贮于棕色液瓶中，贴好标签后放入冰箱内低温保存。NAA（萘乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、IAA（吲哚乙酸）、2,4-D（苯氧乙酸）般多用少量95%乙醇溶解，然后加热的蒸馏水定容。（B） 细胞分裂素类 溶于或1mol/L的HCL或浓度小的NaOH中

48、，然后用去离子水或蒸馏水定容，贮于棕色液瓶中，贴好标签后放入冰箱内低温保存。KT（激动素）、BA（6-苄基嘌呤）可先用少量1N盐酸溶解，然后加热的蒸馏水定容。ZT（玉米素） 先用少量95%乙醇溶解，再用热的蒸馏水定容。（C） 赤霉素类 赤霉素易溶于冷水，但溶于水后不稳定，易分解，最好用95%的乙醇配成母液存于冰箱。用时用去离子水或蒸馏水稀释到需要的浓度。（6）其他（A）三十烷醇 取溶于5mL二氯甲烷中，再加入10mL吐温80，搅拌至溶解后加蒸馏水至100mL，继续高速搅拌至乳白色，即成0.1%乳液，存于冰箱中备用。若储存时间过长发生乳析现象，应先猛烈震荡再使用。（B）叶酸 叶酸需先用少量氨水溶

49、解，用去离子水或蒸馏水定容。贮备母液都应贮存于适当的玻璃瓶中，分别贴上标签，标注母液名称、配制倍数、日期及配制一升培养基时应取的量，母液最好放置于冰箱中低温（24）保存，特别是生长调节物质与有机物类物质，贮存时间不要太长。在贮备椰子汁（液体胚乳）的时候，要先把从果实中采集到的汁液加热煮沸，以除去其中的蛋白质，过滤，然后置塑料瓶中贮存于-20的低温冰箱内。在使用这些贮备液之前必须轻轻摇动瓶子，如果发现沉淀悬浮物或微生物污染，必须重新配制。应当注意的是某些生长调节物质如生长素、玉米素、脱落酸、赤霉素等以及某些维生素遇热不稳定，不能和其他营养物质一起高温灭菌，而要进行过滤灭菌。每次配制培养基时，吸取

50、母液量（mL）=所配培养基的毫升数/母液浓度倍数。如果配制1000mL培养基，并且母液浓度倍数为200倍，则吸取母液量（mL）=1000mL/200倍=5mL培养基无机营养研究规律：成分 配方(mg/L) 分子量 摩尔浓度NH4NO3 1650 80 20mmolKNO3 1900 101 19mmol KH2PO4 170 MgSO47H2CaCl22H2O 440 147 3mmolFeSO47H2O 27.8 278 0.1mmol Na2成分 配方(mg/L) 分子量 摩尔浓度MnSO44H2ZnSO47H2H3BO3 6.2 62 KI 0.83 166 0.005mM Na2MoO

51、42H2CoCl26H2CuSO45H264 培养基的配制（1）培养基配制步骤 配好各种母液后，就可以准备配制培养基了。配制培养基时可按如下步骤进行，如图。 大量 微量 铁盐 有机物 生长调节剂 蔗糖 琼脂 加水混合 调节pH值（用1N HCl或1N NaOH） 加热溶解 玻璃器皿水洗、干燥 分装 封口 高压蒸汽灭菌 培养基冷却凝固 培养基存放 准备接种（C） 培养基的分装 将调整好pH值的琼脂培养基要趁热分装到培养容器中，琼脂在大约40时凝固。一般每瓶约40mL左右，塞上棉塞或用封口膜等封瓶口材料封口，再用线绳或橡皮筋捆扎。及时做好标记。七 外植体（1）外植体种类从理认上讲，植物细胞多具有全

52、能性，若条件适宜，都能再生成完整植株，任何组织或器官多能作为外植体。但实际上，植物种类不同，同一植物不同器官、同一器官不同生理状态，对外界诱导反应的能力及再生能力是不同的。A、植物基因型 草本比木本易于组织培养，双子叶植物比单子叶植物易于培养。 B、外植体来源 从田间或温室中生长健壮的无病虫害的植株上选取发育正常的器官或组织作为外植体，离体培养易于成功。对于大多数植物来说，茎尖是较好的外植体，由于茎尖形态已基本建成，生长速度快，遗传稳定，也是获得无病毒苗的重要途径。也可以用叶片、茎段、根等。 C、外植体大小 外植体大小应根据培养目的而定，如是胚胎或脱毒培养，易小。如进行快繁易大。但过大不易灭菌

53、，过小难以成活。一般在为宜。叶片、花瓣5mm2，茎约，茎尖分生组织带一两个叶原基(2)植物材料的表面灭菌 A 外植体的灭菌方法植物生长在大自然中，而在大自然中无时无刻不存在各种微生物，处处都有杂菌滋生，因此，从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。采来用于培养的植物材料，不能直接进行培养，必须经过仔细的表面灭菌处理后，获得无菌材料后才能进行培养。把处理好的材料经无菌操作手续放置到培养基上，即接种，接种的植物材料叫做外植体。实践表明，外植体材料来源于不同环境条件下，其带菌程度不同，灭菌难易程度和灭菌效果有明显差别，采自田间的试材较温室的材料难，新生嫩芽比老枝梢的芽容易，夏季生长旺

54、盛季节抽出的新芽灭菌效果好，污染率低。外植体取材自来水冲冼-70%酒精表面消毒（20-60S）-无菌水冲冼消毒剂处理无菌水充分冲冼-备用。第一步是刷洗、冲洗材料。采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分用适当的软毛刷、毛笔等在流水下刷洗干净，也可以用毛笔沾少量洗衣粉刷洗。然后把材料切割到适当大小，根据清洁程度的差异，置于烧杯中，用流水冲洗几分钟至数小时，细小或易漂浮的材料可用纱布、塑料纱窗或铜丝网笼扎住。第二步是用洗衣粉或肥皂水浸洗并搅动，洗衣粉可按每100 mL水加12角匙的量配制，即浓度较高为好。大约浸搅15min，然后再用自来水冲净洗衣粉，进一步减少污染。此过程可视外植体具体情况而定，

55、较干净的或容易处理的可以省略此步骤第三步是材料的表面灭菌，要在超净台或接种箱内操作。将一干净烧杯(大小视材料多少而定)或广口瓶内、外表面用70%或80%酒精棉球擦拭作表面灭菌，置于超净台(已开机10min以上)，再把处理好的植物材料置入，同时已准备好了灭菌溶液、无菌水、待用培养基等。工作人员换上洁净的工作服，戴上帽子。用肥皂洗手至肘部，用洁净毛巾擦干，用70%酒精棉球擦手。在超净工作台前，附近应放有座钟或表，把沥干的植物材料转放到灭菌过的烧杯或广口瓶中，看好时间，倒入灭菌溶液，加表面活性剂吐温-80数滴，在持续灭菌的时间内轻轻摇动广口瓶，以促进植物材料各部分与灭菌溶液充分接触，驱除气泡，使灭菌

56、彻底。在快到预定时间之前12min，即开始把灭菌溶液倒入另一准备好的大烧杯中，要注意勿使材料倒出。倾净后立即倒入无菌水，轻轻摇动。表面灭菌的时间是从倒入灭菌溶液开始，到倒入无菌水时为止，加以记录，为今后比较灭菌效果，积累经验。无菌水冲洗每次3min左右，视采用的灭菌溶液种类不同，一般冲洗310次。冲洗完毕后，这时的材料就可以接种了。另外，要选择适当的灭菌剂。目前市场上供应的一些化学灭菌剂都具有表面灭菌的作用，而在试剂的选择上与时间长短的处理上则应根据材料对它的敏感性来决定。表4-3为常用表面灭均剂使用浓度及效果比较。 B 灭菌剂及其效果灭菌剂要求既要有良好的灭菌作用，又要不会损伤外植体材料，或

57、较少损伤材料，还要易被无菌水冲洗掉或能自行分解，不会遗留在培养材料上而影响生长。常用的灭菌剂有漂白粉（1%10%的滤液）、次氯酸钠液（0.5%10%）、升汞（氯化汞，0.1%1%）、酒精（70%）、双氧水（3%10%）。其中次氯酸钠能分解产生具有杀菌作用的氯气而挥发。过氧化氢液会分解产生具有杀菌作用的氧气而成无害的化合物。升汞有剧毒，对材料的表面灭菌效果好，只是灭菌后难易除去残留的汞，为此灭菌后要多次冲洗，升汞的毒害作用不象漂白粉那样可以很快表现出来，一般要经过一段时间培养后才会表现。漂白粉是一种有效的杀菌剂，但应避光、干燥保存。70%酒精比其他浓度的酒精有更强的杀菌能力和穿透力，而且有湿润作

58、用，可排除掉材料表面的空气，利于其他灭菌剂的渗入，由于酒精穿透力强，故应严格掌握好处理时间。为了使杀菌剂润湿整个组织表面，还需在药液中加入润湿剂。常用的润湿剂有吐温（Tueen）80，或吐温20，可加入数滴或用0.1%的浓度，对组织的湿润有良好的效果。 常用表面灭菌剂使用浓度及效果比较灭菌剂, 浓度（%）, 去除, 时间, 效果次氯酸钙, 910, 易, 530, 很好次氯酸钠, 2, 易, 530, 很好漂白粉, 饱和溶液, 易, 530, 很好溴水, 12, 易, 210, 很好过氧化氢, 1012, 最易, 515, 好氯化汞, 0.11, 较难, 215, 最好酒精, 7075, 易,

59、 0.22, 好抗生素, 450mg/L, 中, 3060, 较好硝酸银, 1, 较难, 530, 好八、外植体接种与培养九、 继代培养组织培养中，培养物（细胞、愈伤组织、器官、试管苗等）培养一段时间后，为了防止培养的细胞团老化，或培养基成分利用完而造成的营养不良及过多代谢产物积累毒害等影响，要及时将其转到新的培养基中，进行继代培养，使培养物能顺利的增殖分化及生长。继代培养时间的长短因植物材料不同、培养方法与目的不同而不同。一般液体培养1周继代一次，固体培养2-4周。十 植物组织 器官培养技术一、植物组织培养一般步骤阐述植物组织培养的基本过程：（1）准备工作（2）培养基制备（3）外植体制备（4

60、）接种（5）培养（6）定期检查（7）移栽、炼苗诱导愈伤组织的成败关键主要不是实验材料，而是培养条件，其中激素的成分和浓度是最重要的因素。 最常用的生长素是IAA，NAA和2，4D，使用浓度范围约在。最常用的细胞分裂素是KT和6-BA，使用浓度范围在10mg/L。二、愈伤组织培养过程（1）愈伤组织的形成起动期：外值体（explant）中已分化的活细胞在外源激素的作用下，通过脱 分化的起动期而进入分裂，并开始形成愈伤组织。特征：外观上虽然未见明显变化，但实际上细胞内一些大分子代谢动态已发生明显的改变。 脱分化起始期的实质是在外源生长素的诱导下，首先激活了这些细胞中特定基因表达，为细胞分裂期的DNA