生物化学第二章蛋白质

1、 第二节 肽蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到106道尔顿甚至更大 一. 基本问题-肽 一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。 由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。 1.多肽在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一

2、个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln 2.肽键 肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。3 肽的化学性质 肽键中的亚氨基虽然不能解离，但肽链带有游离的N-端-NH2和C端-COOH，加上部分氨基酸可解离的R基团，因而与氨基酸一样具有两性解离的性质。 肽的化学反应与氨基酸一样，游离的-氨基、 -羧基、R基团可发生与氨基酸中相应基团类似的反应

3、，如茚三酮三酮反应、sanger反应、Edman反应等。 含有两个以上肽键的化合物在碱性溶液中与Cu2+生成紫红色到蓝紫色的络合物，称为双缩脉反应，可用以测定多肽和蛋白质含量。 4.天然存在的重要多肽 在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。肽类激素：如促甲状腺素释放激素（TRH） 谷胱甘肽(glutathione, GSH)谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽谷氨酸的-羧基形成肽键SH为活性基团为酸性肽是体内重要的还原剂谷胱甘

4、肽是某些氧化还原酶的辅酶，对巯基酶的-SH基有保护作用，且有防止过氧化物积累的功能-2H+2H2GSH GSSG-2H+2H参与氧化还原反应传递氢GSH的作用解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态； 维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。一种抗菌素1 N-端（氨基端、NH2-端）C-端（羧基端、COOH-端）氨基酸残基 （110或108）2 肽的结构和命名习惯：按数量的多少、按来源、按功能 二肽、三肽、四肽等、多肽 系统：某氨基酰某氨基酰某氨基酸 重要

5、的肽（生物活性肽）介绍保健品行业的热点。3 肽链表达式 从N(OH)到C (H) ，具方向性三字母符号或单字母符号表示，中间用“”或“-”表示。一级结构中的相关术语 第三节 蛋白质的分子结构 一. 蛋白质的一级结构 1. 蛋白质的一级结构(Primary structure)： 即多肽链内氨基酸残基从N末端到c末端的排列顺序，或称氨基酸序列，是蛋白质最基本的结构。共价结构包括： (1)组成蛋白质的多肽链数目， (2)多肽链的氨基酸顺序， (3)多肽链内或链间二硫键的数目和位置。 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。2 一级结构测定基本战略：片段重叠法氨基酸顺序直测法 要

6、点：a.测定蛋白质的分子量及其氨基酸组分 b. 测定肽键的N末端和C末端 c. 应用两种或两种以上的肽键内切酶分别在多肽键的专一位点上断裂肽键；也可用溴化氰法专一性地断裂甲硫氨酸位点，从而得到一系列大小不等的肽段。 d. 分离提纯所产生的肽段，并分别测定它们的氨基酸顺序 e. 将这些肽段的顺序进行跨切口重叠，进行比较分析，推断出蛋白质分子的全部氨基酸序列。蛋白质顺序测定基本战略将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 将肽段分离并测出顺序专一性裂解末端氨基酸测定二硫键拆开纯蛋白质一级结构研究测序前提：样品必须是均一的(纯度大于97%)必须知道它的相对分子量，其误差允许在10%以内过程： 1.测定蛋白

7、质分子中多肽链的数目 2.拆分蛋白质分子的多肽链 3.断开链内二硫键 4.分析每条多肽链的氨基酸组成比及数目 5.鉴定多肽链的N、C瑞残基 6.裂解多肽成小的肽段 7.测各肽段的氨基酸序列 8.重建完整多肽链的一级结构 9.确定二硫键的位置二、 蛋白质的构象和维持构象的作用力1 构型与构象 构型：立体异构体分子中取代原子或基团在空间的取向，如几何异构体和光学异构体。构型互变需要共价键的断裂。 构象：取代基团当单键旋转时形成不同的立体结构这种空间位置的改变不涉及共价键的断裂。2 维持蛋白质构象的作用力 蛋白质天然构象的稳定性主要是靠一系列弱作用力维持的，这些弱作用力主要有氢键、盐键、疏水作用、范

8、德华力，此外还有共价二硫键、酯键和配位键。 1氢键 多发生在多肽链中负电性很强的氮原子或氧原子与NH或OH的氢原子之间。另一方面，水分子的氢原于和羟基基团也能和多肽链的有关原子或基团形成氢键，蛋白质表面的侧链通常倾向于形成这类氢键。2范德华力 一般是指范德华吸引力。3疏水作用 疏水作用实际上不是疏水基团之间相互吸引，主要是介质水分子对疏水基团的推斥所致，或者说是由于疏水基团为了避开水分子而被迫靠近。4盐键 又称离子键，蛋白质分子中的某些氨基酸，其侧链是带电荷基团，它们之间可以形成离子键。 5二硫键 多肽链内或不同链间的两个Cys残基的巯基，在氧化条件下形成二硫键。 6配位键 两个原子之间由单方

9、面提供共用电子对形成的共价键称为配位键。疏水相互作用力范德华力离子键氢键维持蛋白质分子构象的作用力a.盐键 b.氢键 c.疏水键 d.范得华力 e.二硫键多肽链三. 蛋白质的二级结构 蛋白质的二级(Secondary)结构是指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。（1）肽单元 (peptide unit) 参与组成肽键的6个原子位于同一平面，又叫酰胺平面或肽键平面。它是蛋白质构象的基本结构单位。 绕CN旋转的角称，而绕CC旋转的角称。这两个角称为C原子的二面角肽单元HHHH完全伸展的多肽主链构象-碳原子酰胺平面=1800，=

10、1800=00，=00的多肽主链构象酰胺平面=00，=00侧链非键合原子接触半径 （2）蛋白质二级结构的主要形式 -螺旋 ( -helix ) -折叠 ( -pleated sheet ) -转角 ( -turn ) 无规卷曲 ( random coil ) （1）-螺旋（ - helix）H2N-端COOH-端 -螺旋结构要点: 多肽链主链围绕中心轴形成右(或左)手螺旋，侧链伸向螺旋外侧。 每圈螺旋含3.6个氨基酸，螺距为0.54nm。 每个肽键的亚氨氢和第四个肽键的羰基氧形成的氢键保持螺旋稳定。氢键与螺旋长轴基本平行。多个肽键平面通过-碳原子旋转，绕一条固定轴形成右手螺旋（N-端至C-端方

11、向）每3.6个氨基酸残基上升一圈，相当于0.54nm,每个残基绕轴旋转100，沿轴上升0.15nm相邻两圈螺旋之间借肽键中CO和N-H形成许多链内氢健，即每一个氨基酸残基中的NH和前面相隔三个残基的CO之间形成氢键（1-5），这是稳定-螺旋的主要键。肽链中氨基酸R侧链，分布在螺旋外侧* 影响-螺旋稳定的因素： R基大小：较大的R(如苯丙氨酸、色氨酸、异亮 氨酸)、Gly空间占位很小，电荷：带同种电荷的R基无法形成Pro存在 出现“拐角”。结构要点如下：多肽链呈锯齿状（或扇面状）排列成比较伸展的结构；有平行式和反平行式两种，相邻两个氨基酸残基的轴心距离反平行为0.35nm，平行为0.325nm，

12、侧链R基团交替地分布在片层平面的上下方所有肽键的C=O和NH形成链间氢键，方向：与轴垂直；-折叠-转角和无规卷曲-转角：无规卷曲：没有确定规律性的肽链结构。 肽链内形成180回折。 含4个氨基酸残基，第一个氨基酸残基与第四个形成氢键。 第二个氨基酸残基常为Pro。型-转角的第三个残基总是Gly-转角：无规则卷曲示意图无规则卷曲细胞色素C的三级结构1超二级结构和结构域（）超二级结构蛋白质中相邻的二级结构单位（即单个螺旋或折叠或转角）组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辩认的二级结构组合体称为蛋白质的超二级结构基本组合方式：；超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的

13、结构域 四、蛋白质的三级结构（）结构域 在二级结构的基础上，多肽进一步卷曲折叠成几个相对独立、近似球形的三维实体，再由两个或两个以上这样的三维实体缔合成三级结构，这种相对独立的三维实体称为结构域。 形成意义： 动力学上更为合理 蛋白质（酶）活性部位往往位于结构域之间，使其更具柔性 结构域与功能域的关系： 有时一个结构域就是蛋白质的功能域，但不总是包含一个但通常是多个结构域结构域Triose phosphate isomerase卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域-螺旋-转角-折叠二硫键结构域1结构域22、 蛋白质的三级结构 多肽键在二级结构的基础上，通过侧链基团的相互作用进一步卷曲折叠，借助次级

14、键维系使螺旋、折叠片、转角等二级结构相互配置而形成特定的构象。三级结构的形成使肽链中所有的原子都达到空间上的重新排布。 实例：肌红蛋白 核糖核酸酶核糖核酸酶三级结构示意图 N His12CHis119Lys41 肌红蛋白 (Mb) N 端 C端五、蛋白质的四级结构四级结构是指由相同或不同的称作亚基（subunit）的亚单位按照一定排布方式聚合而成的蛋白质结构，维持四级结构稳定的作用力是疏水键、离子键、氢键、范得华力。亚基本身都具有球状三级结构，一般只包含一条多肽链，也有的由二条或二条以上由二硫键连接的肽链组成。 实例：血红蛋白 烟草花叶病毒的外壳蛋白四级结构烟草花叶病毒外壳蛋白四级结构的自我组

15、装血红蛋白的四级结构 从一级结构到四级结构血红蛋白蛋白质的一级结构是它的氨基酸序列蛋白质的二级结构是由氢键导致的肽链卷曲与折叠PrimarystructureSecondarystructure蛋白质的三级结构是多肽链自然形成的三维结构蛋白质的四级结构是亚基的空间排列Polypeptide(single subunitof transthyretin)Transthyretin, with fouridentical polypeptide subunitsTertiarystructureQuaternarystructure维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键维系蛋白质分子的二级结构：氢

16、键维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键 a盐键（离子键 ） b氢键 c疏水相互作用力 d 范德华力 e二硫键 f 酯键氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键氢键、范德华力虽然键能小，但数量大疏水相互作用力对维持三级结构特别重要盐键数量小二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定离子键氢键范德华力疏水相互作用力离子键氢键范德华力离子键氢键疏水相互作用力范德华力离子键氢键氢键范德华力氢键疏水相互作用力范德华力氢键第四节 蛋白质的分子结构与功能的关系一、 蛋白质一级结构与功能二、 蛋白质高级构象与功能 蛋

17、白质复杂的组成和结构是其多种多样生物学功能的基础；而蛋白质独特的性质和功能则是其结构的反映。蛋白质一级结构包含了其分子的所有信息，并决定其高级结构，高级结构和其功能密切相关。 一级结构决定高级结构，也决定蛋白质的功能1、蛋白质一级结构的种属差异与同源性 实例：细胞色素2、蛋白质一级结构的变异与分子病 实例：血红蛋白质异常病变镰刀型贫血病3、蛋白质前体的激活与一级结构 实例：胰岛素原的激活不同生物与人的Cytc的AA差异数目生物 与人不同的AA数目黑猩猩 0恒河猴 1兔 9袋鼠 10牛、猪、羊、狗 11马 12鸡、火鸡 13响尾蛇 14海龟 15金枪鱼 21角饺 23小蝇 25蛾 31小麦 35

18、粗早链孢霉 43酵母 44 不同生物来源的细胞色素c中不变的AA残基14106100134323029271817675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血红素细胞色素c分子的空间结构不变的AA残基 35个不变的AA残基，是Cyt C 的生物功能所不可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与“识别”并结合细胞色素还原酶和氧化

19、酶。正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图镰刀形红细胞正常红细胞-链N端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人） Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患 者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys 这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。猪胰岛素原激活成形成胰岛素示意图 高级构象决定蛋白质的功能1 、蛋白质高级构象破坏，功能丧失 实例：核糖核酸酶的变性与复性2 、蛋白质在表现生物功能时，构象发生一定变化（变构效应） 实例：血红蛋白的变构效应和输氧功能核糖核酸酶变性与复性作用Native rib

20、onucleaseDenative reduced ribonucleaseNative ribonuclease8 M urea and -mercapotoethanolDialysis变性复性血红蛋白输氧功能和构象变化O2HbHb- O2O2血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线活动肌肉毛细血管中的PO20 20 40 60 80 100肺泡中的PO2MyoglobinHemoglobin疯牛病疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。

21、PrPc-螺旋PrPsc-折叠正常疯牛病 第五节 蛋白质的重要性质一.蛋白质的分子大小蛋白质是分子量很大的生物分子，相对分子质量大于10 000.最高可达40 000 000（烟草花叶病毒） 蛋白质相对分子质量的测定方法1.根据化学成分测定最小相对分子质量 此法首先利用化学分析方法测定蛋白质分子中某一特殊成分的百分含量，然后，假定蛋白质分子中该成分只有一个，据其百分含量可计算出最低相对分子质量： 最小相对分子质量（已知成分的相对分子、原子质量）/已知成分的百分含量 如果蛋白质分子中所含已知成分不是一个单位，则真实相对分子质量等于最小相对分子质量的倍数。2. 超离心法 在60 00080 000

22、r/min的高速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向移动，用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度，蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关。 沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用S表示。 一个S单位，为110-13秒 相对分子质量越大，S值越大 蛋白质的沉降系数：1200S 由沉降系数S可根据斯维得贝格Svedberg方程计算蛋白质分子的相对分子质量： M=RST/D1i R：气体常数 T：绝对温度 D：扩散系数 ：溶剂的密度3.凝胶过滤法 凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排

23、阻在外。洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大。 测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex 测得几种标准蛋白质的洗脱体积Ve 以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线 再测出未知样品洗脱体积Ve 从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDS:十二烷基硫酸钠，变性剂普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、大小、形状）。用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理，蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成SDS-蛋白质复合物；不同蛋白质分子的均带负电（SDS带负

24、电）；且荷质比相同（蛋白质分子大，结合SDS多；分子小，结合SDS少）；不同蛋白质分子具有相似的构象用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图；测出待测样品的迁移率从标准曲线上查出样品的相对分子质量 影响迁移率的主要因素凝胶的分子筛效应对长短不同的棒形分子会 产 生不同的阻力主要因素凝胶的浓度和交联度同一电泳条件下，分子小，受阻小，游动快，迁移率大。相对分子质量大者，迁移率小 优点：快速，样品用量少，可同时测几个样品 缺点：误差大，约为10（误差主要来源于迁移距离的测量误差） 此方法只能测得 亚基肽链的相对分子质量（一）蛋白质的两性电离 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸

25、残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 二. 蛋白质的两性解离和电泳现象 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。 蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。 蛋白质在溶液中解离成带电颗粒，在电场中可以向电荷相反的电极移动，这种现象称为电泳。（二）蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之

26、一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。 蛋白质胶体稳定的因素胶体溶液是指一定大小的固体颗粒或化合物分散在溶媒中所形成的溶液。 颗粒表面电荷水化膜 由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固 * 蛋白质的变性(den

27、aturation)在某些物理和化学因素作用下，蛋白质分子的特定空间构象被破坏，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。 造成变性的因素：如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。 变性的本质： 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。 应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。 蛋白质变性后的性质改变：溶解度降低、粘度增加、结晶能力消失、生物活性丧失及易受蛋白酶水解。若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。复性(renaturation) 天然状

28、态，有催化活性尿素、-巯基乙醇 去除尿素、-巯基乙醇非折叠状态，无活性* 蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。 * 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 1.可逆沉淀(1)在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。(2) 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。(3)可逆沉淀是分离和纯化蛋白

29、质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。2.不可逆沉淀(1)在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。(2)由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。(3)加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。（四）.蛋白质的紫外吸收 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。(五)蛋白质主要呈色反应 双缩脲反应 酚试

30、剂反应 蛋白质定量、定性 茚三酮反应 测定常用方法 1.双缩脲反应： 两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成红色的复合物。 含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样的反应。 肽键的反应，肽键越多颜色越深。 受蛋白质特异性影响小。 蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度。 2.米伦氏反应酪氨酸的显色反应（酚羟基反应）米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物蛋白溶液中，加入米伦试剂，产生白色沉淀，加热后变成红色3.乙醛酸反应在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成色氨酸的反应（吲哚环的反应）鉴定蛋白质中是否含有色氨酸明胶中不含色氨酸4.坂（

31、ban）口反应精氨酸的反应（胍基的反应）精氨酸与-萘酚在碱性次氯酸钠（或次溴酸钠）溶液中发生反应，产生红色产物鉴定蛋白质中是否含有精氨酸定量测定精氨酸5.福林试剂反应酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应）福林试剂：磷钼酸-磷钨酸 与双缩脲法结合-Lowry法在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应蛋白质-铜络合物，将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物灵敏度提高100倍6.茚三酮反应灵敏度差7.黄蛋白反应浓硝酸与酪氨酸、色氨酸的反应生成黄色化合物指甲、皮肤、毛发8.考马斯亮蓝G-250本身为红色，与蛋白质反应呈蓝色与蛋白的亲和力强，灵敏度高1-1000微克/毫升 第六节 蛋白质的分类一. 依据蛋白质的

32、外形分类 按照蛋白质的外形可分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。1.球状蛋白质（globular protein）：外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。2.纤维状蛋白质(fibrous protein)：分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。如胶原、角蛋白、丝蛋白等。二.依据蛋白质的组成分类 按照蛋白质的组成，可以分为1.简单蛋白(simple protein) ：又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由-氨基酸组成的肽链，不含其它成分。（1）清蛋白和球蛋白：albumin and globulin广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋

33、白微溶于水，易溶于稀酸中。（2）谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于7080乙醇中。（3）精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。（4）硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。2.结合蛋白(conjugated protein)：由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成（1）色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。（2）糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。（3）脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。 如血清-，-脂蛋白等。（4）

34、核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。（5）金属蛋白：由简单蛋白与金属离子的结合物。如铁硫蛋白、铁氧还蛋白、细胞色素类等含铁、铜、锌、钼的蛋白，肌浆钙蛋白、嗜热菌蛋白酶等。（6）磷蛋白：由简单蛋白质和磷酸组成。如胃蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、弹性蛋白、丝心蛋白等。一、蛋白质分离纯化的一般原则 1、前处理 2、粗分级：通常用盐析、等电点沉淀、超滤、有机溶剂分级等简便、处理量大的方法从蛋白质混合液中除去大量杂质，得到浓缩蛋白质溶液。 3、细分级：选用分辨率高的方法进一步提纯，如经过凝胶过滤、吸附层析、离子交换层析、反相高效液相层析、亲和层析以及凝胶电泳、等电聚焦等。第七节 蛋白质

35、的分离和纯化（一）透析及超滤法* 透析(dialysis)：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。* 超滤法：应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 *使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。 *盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 *免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。 （三）电泳蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移