酵母细胞固定化及乙醇发酵

1、实验二酵母细胞固定化及乙醇发酵一、实验目的要求1、掌握微生物细胞固定化的原理和基本技术2、学习酵母乙醇发酵过程二、实验原理（一）固定化细胞（immobilized cell）固定化细胞技术是指用物理或化学的手段将游离细胞定位于限定的空间区域，并使其保持催 化活性、反复使用的方法。近十余年来生物工程研究的重点领域之一；固定化细胞与固定化酶技术 一起组成了现代的固定化生物催化剂技术。优点：细胞密度高、反应速度快、耐毒害能力强、产物分离容易、可反复使用、能实现连续 操作，可大大提高生产能力。应 用：已涉及到食品、化学、医药、化学分析、环境保护、能源开发等领域。用于生产各种 胞外产物，包括酒精酒类、氨

2、基酸、有机酸、酶、辅酶、抗生素、甾体转化、废水处理；用于制造 微生物传感器（二）制备方法：吸附法；包埋法；共价结合法；交联法；1、吸附法：又叫载体结合法，依据带电的微生物细胞和载体之间的静电、表面张力和黏附力 的作用，使细胞固定在载体表面和内部；简便，活力损失小；但细胞与载体作用力小，易脱落2、包埋法：分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。凝胶包埋法是将细胞包埋在各种凝胶内部的微孔中而使细胞固定；半透膜包埋法是将细胞包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内。简单，条件温和，稳定性好，包埋细胞容量高。3、共价结合法：细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接， 从而形成为固定化细胞。细

3、胞与载体结合紧密，不易脱落；但制备较难，且活力损失较大。4、交联法：利用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团（如氨基酸、羟基、咪唑 基等）发生反应，使其彼此交联形成网状结构的固定化细胞，其结合力是共价键。此法制备麻烦，活力损失较大；但细胞与载体结合较紧。（三）载体多糖类：纤维素、琼脂、葡萄糖凝胶、藻酸钙、K-角叉胶、DEAE-纤维素等蛋白质：骨胶原、明胶等无机载体：氧化铝、活性炭、陶瓷、磁铁、二氧化硅、高岭土、磷酸钙凝胶等合成载体：聚丙稀酰胺、聚苯乙烯、酚醛树脂等海藻酸盐是一种广泛应用的固定化介质，具有化学稳定性好、无毒、包埋效率高且价格低廉等 优点。但是海藻酸钙包埋细胞时，凝胶颗粒易

4、发生破损、软化等问题，凝胶颗粒的稳定性和机械强 度较差，不利于固定化细胞的多次利用。三、实验步骤第一阶段酵母菌培养1、培养基配制及分装豆芽汁蔗糖培养基：黄豆芽100g （煮开10min后过滤取汁），蔗糖（或葡萄糖）50g,水 1000ml, pH自然； 或 YPD培养基：酵母膏10g、蛋白豚20g、葡萄糖20g、H2O 1000ml； pH5.5 分装：配制500ml，分装4个500ml三角瓶，每瓶100ml； 0.08Mpa,灭菌20min2、接种及培养：菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）；接种量：5%摇瓶培养条件：200rpm, 28C, 48h第二阶段：

5、细胞固定化3、发酵液3000rpm离心10min；菌体沉淀用灭菌水洗一次。4、将菌体沉淀悬于15ml无菌水制成浓悬液。5、向菌悬液中加入5ml 6%海藻酸钠溶液，充分混匀。吸入灭菌针筒内，插上5#8#针头。6、 将针头通过棉塞插入装有50ml灭菌的0.05mol/L CaCl2溶液的小三角瓶内；一手均速摇动 三角瓶，另一手轻推注射器，令液滴匀速滴入CaCl2溶液中。（如图1）7、滴完后将三角瓶移入22C水浴，放置1h。8、倾去溶液，加入100ml无菌去离子水，洗图1图29、重新加入50ml 0.05 mol/L CaCl2溶液，4C平衡过夜。第三阶段：固定化酵母的乙醇发酵10、发酵培养基配制及

6、分装配方：白糖（蔗糖）80g、（NH4）2SO4 2.0g、KH2PO4 1.0g、H2O 1000ml； pH 自然分装：每组一瓶（250ml注射液用瓶），装200ml，棉塞或8层纱布；0.08Mpa，25min11、将4C平衡过夜的固定化细胞悬液的CaCl2溶液倾去，倒入部分发酵培养基，摇起后再倒回发 酵瓶；塞上灭菌的橡皮塞；将头皮针针头插入橡皮塞，另端浸在装有灭菌水的三角瓶中（如上图2）。12、28 C静止培养48h。13、酒精生成的检验1）打开发酵瓶塞子，嗅闻有无酒精味2）取发酵液5ml加入试管，加10% H2SO4溶液2ml；向试管中滴入1% K2Cr2O7溶液1020 滴；如管内由橙黄色变为黄绿色，证明有酒精生成。2K2Cr2O7 + 8H2SO4 + 3CH3CH2OH 一 3CH3COOH + 2K2SO4 + 2Cr2（SO4）3 （黄绿色）+ 11H2O四、实验结果酵母摇瓶培养生长情况；生长量固定化细