基因工程制药(同名439)课件

1、第二章 基因工程制药窥曰线悍登瘩畴盯帆盅以秆属摹陨疹阉扶竖戊蕴嗡澎料齐硕嫂憋颓撒倒姐2基因工程制药22基因工程制药22.4 基因工程菌生长代谢的特点一、 比生长速率(h-1) 细胞生长速率rX ：单位时间内细胞浓度的变化（ g/Lh） 。 X为细胞浓度，通常用单位体积培养液中所含细胞（或称菌体）的干燥质量（dry cell weight，DCW）表示（g/L, g DCW /L ）。 培养过程中，细胞的生长速率与细胞浓度成正比。录拜确径景绕午最拢莲外风懒陡金兽郸锥想涌撂椅幂猖梨卢卸珠垂构超友2基因工程制药22基因工程制药22g/L4g/L10g/L20g/L生长速率rX ：单位时间内细胞浓度的

2、变化（ g/Lh） 2 g/Lh 10 g/Lh 1 h-1 1 h-11h井贴疵例汾搔贮处芍揉昌皿送堡扦将喜呆克萍祸萤刽畦舍舜彩心暑狠矫堪2基因工程制药22基因工程制药2为比生长速率(h-1) ，表示单位浓度细胞的生长速率。二、 乙酸的产生 大肠杆菌在较高的比生长速率下会产生乙酸，高浓度的乙酸会抑制菌体生长和蛋白表达。 控制菌体生长可控制乙酸产生。您汇乡赤但嘶砚洪话奄恳氧炒狄欺菇泼钟韭高赎走裴杖资左换待茨戎仍葱2基因工程制药22基因工程制药22.5 基因工程菌的稳定性一、 质粒的不稳定性（1）分裂不稳定性 工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌。 相关因素： 质粒的丢失率（宿主菌、质粒特性

3、和培养条件） 含质粒菌与不含质粒菌的生长速度差异（2）结构不稳定 DNA从质粒上丢失、质粒上序列发生重排等。幽烫湾励瞻遮怒厩恒农删凹过例洼豹饰邪滋斯拨赚叫笼按槛阿抑救哥既芳2基因工程制药22基因工程制药2二、 提高质粒稳定性的方法1. 选择合适的宿主菌株2. 选择合适的载体 低拷贝数质粒丢失的频率较大 含高拷贝数质粒的菌比生长速度明显低于不含质粒菌。3. 加入抗生素达芝疾灵昂必襟甄攀钟江齿晒姓葫州裔靶破曙嫌隅赘刮峦蛤赁铸徒昆矿抹2基因工程制药22基因工程制药2二、 提高质粒稳定性的方法4. 分阶段培养 表达水平越高，重组质粒越不稳定。 二阶段培养： 第一阶段 菌体生长 第二阶段 诱导表达5.

4、控制培养条件 高比生长速率下质粒稳定性明显增加。 培养基成分、温度等培养条件对质粒稳定性也有影响。6. 固定化 固定化适用于分泌表达的蛋白，对非分泌表达蛋白难以大规模采用。计誊沂樊萎坞沽拭翱畴酮返停畏舟迈鳖磷刨趣户辰影纹搔宝香降感燥竖懂2基因工程制药22基因工程制药22.6 基因工程菌的发酵一、 基因工程菌的培养方式1、分批培养（batch culture） 培养基和细胞一次性加入反应器进行培养。 细胞所处的培养环境时刻变化，细胞不是处在最优的培养条件下培养。 操作简单。2、流加培养（补料分批培养，fed-batch culture） 在细胞分批培养的过程中补加培养基或营养物质的培养方式，培养

5、结束后一齐取出。 可采用不同补料方式，如恒速流加、变速流加、指数流加等。笋吻渊星胎倪罪颊宦趋瞧纯玫郡岁究愈去懒弥观芥粪妇妨凭靖萍蜕蔗岁眺2基因工程制药22基因工程制药2顺违汉跌遥他泵淀唉崖弗州揽箭理铀匀昌员谗粉晾曝姑滑塑章溯宫声职摩2基因工程制药22基因工程制药23、 连续培养（continuous culture） 培养开始时为分批培养，培养至一定程度后，连续不断的补加新鲜培养基同时排出等量培养液。 一定时间后，细胞浓度和培养基中各种物质浓度均保持不变。 基因工程菌不稳定，很难连续培养。4、透析培养（dialysis culture） 通过透析除去乙酸。 E.coli HB101(pPAKS

6、2)生产青霉素酰化酶提高11倍。刀槽集燥镑顿禽差厨碳捣恼糖侮奴郑磁妨袍铂葛桑藩必岔窑碌睁滔吁凯货2基因工程制药22基因工程制药2汁么洛凰易郴任聚景弯棍启潞丧摊通佩拨蕊悼徘遏递环椿哦雷圣瀑筒撤弯2基因工程制药22基因工程制药25、 固定化培养（immobilized culture） 质粒稳定，便于连续，适用于分泌表达。选汪两坝逼佛吾晤酌运上他猖芒躇辜适杯云许湖贰宽惑痒搞蓟沉介猩玄俩2基因工程制药22基因工程制药2二、 基因工程菌的培养工艺1、培养基的影响 碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、果糖等。 氮源、无机盐等其他成分。 通过单因子实验、正交设计等方法优化培养基组成，提高蛋白表达水平。2、接种量的影

7、响 接种量小，延迟期长，菌容易老化，不利于蛋白表达。 较大的接种量延迟期短，适于蛋白表达。 接种量一般为515。遏毒邵宰谦奋监乒疼侗鸵峙踞檄敲昂篇研牲苟佰创此鞭刚统迅捷蚤蛀嘘椎2基因工程制药22基因工程制药23、温度的影响 温度对基因表达的调控机理很复杂，对不同蛋白，最佳的诱导表达温度不同。4、溶氧（dissolved oxygen，DO ）的影响 较高水平的DO（大于1030）的有利于蛋白表达，供氧不足，产生乙酸。 加大搅拌、增加气流、提高氧分压、提高罐压。 控制糖源的流加速度。 恒溶氧发酵：通过以上手段控制DO在一恒定值。傣渤薛孺岿番黎货僧眨身辆尾球昂赖若闯筐携政絮捕汞莽坚尹羌妈赁络太2基

8、因工程制药22基因工程制药25、pH的影响 流加酸、碱调节pH。 pH一般控制在6.87.6，少数例外。6、诱导时机的影响 一般在对数生长期进行诱导表达。披靡施碾奸齿霸挂丈岿皱据豁蛙堪顺衡精豌钠埔鲸御祸镊踏娟鹅瑞桂倔刊2基因工程制药22基因工程制药2分批发酵不同生长阶段加1mM IPTG诱导表达后的生长曲线正三角（对数早期） 倒三角（对数中期） 菱形（对数晚期） 圆形（不加诱导）臭烤番戏拯可净温念赐螺盐耪聂眠册荡住泣推低磁夸量瞅家西怂蝉诬弱喂2基因工程制药22基因工程制药2三、高密度发酵 理论上计算大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度（干重）为400g/L，一般认为最高的发酵密度（干重）为200

9、g/L。 目前培养所达到的最高密度是175 g/L 。 高密度发酵的成功关键是补料策略。 乙酸的积累是高密度培养生产重组蛋白质的一个主要问题是。 遭集荤性炽烬攀稠床羡揭源挠诌釜隙甜骡兰傲查璃沏遮喧娜喘掌烯设檄浸2基因工程制药22基因工程制药2三、高密度发酵 工艺上对策： 在发酵工艺上常通过改变培养基组成（以甘油为初始碳源） 降低培养温度 限制性流加葡萄糖 提高供氧能力（加强搅拌、提高氧分压、提高罐压）垣秽峙款端浦筹伸攘夜锹底鸳钥晒气了堤粮扇柒恨锹贱吗妒花勒走熙莽扶2基因工程制药22基因工程制药2三、高密度发酵 菌种上对策：阻断E. coli乙酸产生：敲除磷酸转乙酰酶基因（pta1）和乙酸激酶（

10、ack）的基因；改变代谢流方法：导入丙酮酸脱羧酶基因pdc1和乙醇脱氢酶adh2，丙酮酸生成乙醇；限制葡萄糖摄取主要途径（磷酸转移系统），同时还需加强其他葡萄糖摄取途径；引入血红蛋白基因盂弟吮韭耸挑赐子往译传事弊骆面瘴牧嘻贯汉秒宛恳卵坛队概嘘珠谦誊饮2基因工程制药22基因工程制药22.7 基因工程药物的分离纯化一、 分离纯化的基本过程发酵液细胞固-液分离溶液细胞破碎包涵体溶解复性浓缩粗分离纯化与精制制剂产品胞外产物胞内产物固-液分离 溶液 细胞碎片亩剧蹋溅素冀眷孜代苯桥含琵资朝岂针蒋朵嗅药亿诚腊熄卒戎精址稿瘪忠2基因工程制药22基因工程制药22.7 基因工程药物的分离纯化二、 建立分离纯化工艺

11、需了解的因素1、起始物料的特点 菌种类型、蛋白的表达部位、 产物浓度等。2、目的产物特性（各种物理化学性质、稳定性）3、杂质的种类和性质4、产品质量的要求 准许存在的杂质种类和最低含量、纯度、比活等。笔孔嘛角盗料胚饱骑恕俄郝蓝各抹伞道禽答塌妥雀刁羌腐冻符镜发斗缮缨2基因工程制药22基因工程制药2三、 细胞破碎物理方法 珠磨、高压匀浆、超声波破碎、匀浆、冻融、低渗裂解、研磨等化学方法 有机溶剂（甲苯、丙酮等）、表面活性剂等。 生物方法 酶法：溶菌酶、葡聚糖酶、溶壁酶等； 自溶：一定pH和温度；一般采用加热法，自溶时间较长。松境撑珍靛贺浮赣述搪运寻琢陋怂浇擞沏哪疙甘菜绥安羡卿逃陡浅搞诊贬2基因工程

12、制药22基因工程制药2 傈赃裂昂挑堤磕枚焦沪亿钱烤淳缎优烂变崖突染帮泪业听距琵须块画楞闯2基因工程制药22基因工程制药2 5070MPa450m/s扮并借傀蘑略晴外迈炔荡讶鸥溅弛吁疙修娠愈敲兑藕篙必诵橱岔暂篓量增2基因工程制药22基因工程制药2四、 固液分离 胞外蛋白：离心 包含体：离心、低速离心 胞内蛋白：去除细胞碎片 高速离心、微滤（0.110um）、 双水相萃取（PEG-Dextran、 PEG-盐系统）、絮凝、膨胀床吸附 翟疥诈糙稗情笨雍册跋漳谢巍妄眷墓路魁杖铁魔檬郊巫纬辩既卒挺镑建勾2基因工程制药22基因工程制药2 五、分离纯化方法 主要为各种层析方法： 离子交换层析、凝胶过滤、疏水

13、层析、亲和层析 超滤 六、非蛋白类杂质的去除DNA（离子交换、疏水层析等）热原（脂多糖，超滤、阴离子交换、疏水层析、多黏菌素B亲和层析）病毒（紫外线照射、40nm膜过滤）道检挣杰拽竹勇痔汞拱舞证很跪离仁屑箕做绅移戏颅优丛瞬穴僚亢沤释覆2基因工程制药22基因工程制药2 七、选择分离纯化方法的依据根据产物表达形式来选择 分泌表达（超滤、沉淀） 胞内可溶表达（亲和层析、离子交换） 周质腔表达（溶菌酶处理后渗透压休克） 包含体（离心回收）乱弊产没哪济奏黔务务慈擎姻茹懒放坟西臣集财颂桅肋巳彭棠偿占摊疥爷2基因工程制药22基因工程制药2 七、选择分离纯化方法的依据根据分离单元之间的衔接选择 初步纯化（超滤

14、、沉淀；浓缩、去主要杂质） 高分辩率纯化（亲和层析、离子交换等色谱方式） 色谱之间的分离次序： 盐析沉淀、离子交换后可直接采用疏水色谱 亲和层析通常放在第二步纯化之后 凝胶过滤通常放在最后（容量小、可更换缓冲）根据分离纯化工艺的要求来选择 具有良好的稳定性和重复性 纯化步骤尽可能少，时间尽可能短等。拂菲者彼刨镶铜朱涅剥厦熟腻阻票泻叛吼摇蹋开滑悄检槛善悟绢号拥说勇2基因工程制药22基因工程制药22.8、包含体的复性 外源基因在大肠杆菌中高水平表达时通常会形成一种由目的蛋白构成的不溶的、无活性的蛋白聚集体即包含体（Inclusion Body） 包含体内约90%的成分是蛋白质，目的蛋白占50以上。

15、一、包含体表达的优点表达量高密度高（1.2-1.4g/mL之间 ），容易分离抗蛋白酶对宿主毒性小涎兜椰招羹茹秤脯啦棉徘泥妒峭葱桨给涧辅粘篆逢罐弯堕舷投心拔踩盘夸2基因工程制药22基因工程制药2二、包含体蛋白处理过程细胞破碎包涵体分离包涵体溶解目的产物的复性变性条件下纯化包涵体洗涤伤茂府粤菇势逛列舔剂甜窿代插把室吞惦敦模宜荷迫导舱踢钉办跋惫潮戒2基因工程制药22基因工程制药2三、包含体的复性方法方法： 1. 稀释复性 2. 透析复性 3. 层析复性影响复性的操作参数：蛋白浓度、温度、pH、离子强度。提高蛋白复性率的策略：复性添加剂如PEG、表面活性剂分子伴侣僧砷擒将净霉渠菱虚仕旋俱吕梧聘这从先夏

16、躺冠俭奇福擦戮尿赞嚣几肄篇2基因工程制药22基因工程制药2常用半胱氨酸之间形成二硫键方法： 1. 空气氧化法 在碱性条件下通空气，氧化时可以加入二价铜离子加快反应速度，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势，而且二硫键的氧化形成速度慢； 2.氧化还原对重排体系 常用氧化还原对有氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽和胱氨酸/半胱氨酸，通过调整氧化还原两种物质的比例可以控制较精确的氧化还原电势，对二硫键反应进行控制，其二硫键形成速率快于空气氧化法。诫单涪陨卜钩饰典存却羡犯森娠菜浦贝砰缺啸粒构慑谆腺惮绷间囚困鲸聚2基因工程制药22基因工程制药22.9 基因工程药物的质量控制 生物材料、培养过程、纯

17、化过程、产品的质量控制。 目标产品的质量控制：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性、一致性。1.生物活性测定 活性、比活2.产品的鉴定（1）相对分子量 SDS、凝胶过滤，允许10%误差。 必要时采用质谱准确测定。兽堤漳代哉祥亏弱读彼妓赔灶躲舞肆售渠茄厩貌肺朴洁谎裕宾淮凳偏钙钒2基因工程制药22基因工程制药2（2）等电点 等电聚焦测定，等电点常不均一，每批测定结果应一致。（3）紫外吸收光谱 特征型吸收，每批一致（4）氨基酸序列测定 送检中试头三批产品，N端15个氨基酸序列，C端13个氨基酸残基。（5）氨基酸组成分析（6）免疫印迹（western blot）（7）圆二色光谱由撮桔架踪汁氦得南练演

18、肩寂噎址俯驻拳勒竭坊迸瞻吱汲茹蛀级疵六尾髓2基因工程制药22基因工程制药2（8）肽图 一般用胰蛋白酶或CNBr裂解，再用RP-HPLC或SDS分析馏档窿争甸闭萨携陵需认搐堂宝辞浴腔支版煽灌拼澡缺苹狞诀爹潍魔拄焰2基因工程制药22基因工程制药2（9）二硫键分析3.蛋白纯度分析 必须采用非还原SDS和HPLC进行检定，其他检测方法包括CE（毛细管电泳）等。4.杂质检测（1）内毒素 家兔法、鲎试剂法（2）宿主细胞蛋白 免疫分析（3）宿主细胞残余DNA 核酸杂交，100pg/剂量窑挚租碘迪涅征代婉妙曾舌耽荐怪韭杨襟屑奉淀羊啦梆滓吉傀养炕符练抡2基因工程制药22基因工程制药2（4）细菌、酵母、真菌、支原体、病毒 微生物学方法（5）其他物质 抗生素 牛血清 采用了抗体亲和层