样品前处理技术及应用

1、 样品前处理技术的 进展与应用辽宁省疾控中心理化技术检测所1一、样品前处理的重要性 在化学分析中，样品前处理一个最常见的问题。据统计，人们常常将60%的时间花在样品前处理上。这不但不符合高效率的要求，而且烦琐的传统样品处理方法也直接影响到最后的分析结果。 21 样品前处理内容样品前包括处理：样品采集和制备 1.1 一般液体样品的处理：（1）液体的转移（2） 液体的稀释（3）液体的混合（4）标准物的添加3样品前处理1.2 分离提取等其他处理 (1)液-液萃取 （2）蒸馏（3）液-固萃取 （4）固相萃取（5）超声提取 （6）微波法（7）超临界流体萃取（8）膜透析法（9）生物样品水解、蛋白沉淀（10

2、）离心/过滤 （11)蒸发浓缩（12）消解42 重要性-以农药残留分析为例2.1 需要检测痕量或超痕量残留水平。2.2 待测样品污染源的未知性和样品种类的多样性2.3 同时进行多残留检测。2.4 结论：萃取、净化技术等样品前处理是残留分析的关键。因而选择适当的样品处理方法或多种手段联合使用，是成功完成样品分析的 基础。5样品分析过程中各程序所花费的时间数据处理 27%样品处理 61%分析 6%采样 6% From: LC-GC Intl. Vol. 4, No. 2, 19916色谱过程中的误差来源标准曲线 9%仪器 8%色谱 7%积分 6%进样 6%交叉污染 4%样品处理 30%操作 19

3、%色谱柱 11%73 国际上前处理技术发展 80年代中后期，国际上针对传统萃取技术的不足，发展了固相萃取（SPE）技术和超临界流体萃取技术(SFE) ； 90年代以来，又出现了固相微萃取技术（SPME）、液相微萃取（LPME）、基质固相分散萃取技术（MSPDE）、免疫亲和色谱技术（IAC)等新的萃取技术。 84 我国残留分析前处理现状 我国残留分析普遍应用的萃取分离技术还是索氏抽提、振荡提取和超声波提取等传统技术。样品需要量大、萃取时间长、有机溶剂量消耗大，导致大量有毒废弃溶剂的产生。 结论： 我国的残留萃取技术是制约残留分析速度和分析效率提高的瓶颈，无法满足快速、准确的分析要求。9二、样品提

4、取技术理论 提取是一个复杂的过程，是被测组分、样品基质和提取溶剂（或固体吸附剂）三者之间的相互作用与达到平衡的过程。常用的有液-液萃取 ，液-固萃取，柱色谱萃取等。101 液-液萃取(LLE)1.1 定义：液-液萃取 - 利用被测物质在两种互不相溶液体中分配系数不同，从一种溶液中转移到另一种溶液中。 萃取溶剂的选择 （1）溶剂和样品基质不能混溶； （2）待测物和溶剂之间应有最大的分配比 （3）溶剂必须不含有干扰分析的污染物 （4）对检测器的响应值应尽可能小 （5）保留时间和待测物应不相同 （6）溶剂本身应毒性低且易于纯化。111.3 液-液萃取的类型 （1）分次萃取-通常在分液漏斗中进行，将样

5、品和萃取溶剂混合振荡，静置分层后，分出水相。一个样品可用若干份的溶剂进行多次萃取，以提高萃取率。（2）连续萃取-是将样品和溶剂在连续萃取仪器中自动混合，由于连续操作，可减少乳化现象，节省劳力，重现性好。121.4 液-液萃取优缺点优点：（1）技术经典 （2）设备器材简单 （3）操作容易缺点：（1） 易乳化 （2） 回收率不稳定 （3） 选择性差 （4）人为因素影响大 （5）有机溶剂用量大 131.5 乳化现象的防止措施（1）在水相或者乳化液中加入氯化钠或硫酸钠，利用盐析作用加大两相间的密度差异.（2）于3500r/min离心后放置.（3）用玻璃棒机械搅拌，破坏乳化层。142 液-固萃取2.1

6、定义：液-固萃取-利用固态（半固体）样品基质中的待测物质在萃取溶剂中较高的溶解度，使其从样品中转移出来的过程。2.2 应用模式：索氏提取、超声萃取、微波萃取（MAE）、超临界萃取（SFE）加速溶剂萃取（ASE）。153 柱色谱萃取 又称层析技术 。根据其分离原理，有吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱等163.1 柱色谱技术分类（1）吸附色谱-利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体洗脱，以使组分分离。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。17（2）分配色谱-利用溶液中被分离物质在两相中分配系数不同，以使组分分离。其中一相为液体，涂布或使之键合在固体载体上，称固

7、定相；另一相为液体或气体，称流动相。常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。18（3）离子交换色谱-利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换能力不同而使组分分离。常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂，流动相一般为水或含有有机溶剂的缓冲液。 19（4）凝胶渗透色谱-又称排阻色谱，是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等。20 3.2 柱色谱的典型应用：（1）分离（2）净化（3）制备21三 样品提取净化方法及应用221 固相萃取（SOILD PHASE EXTRACTION）1.1 原理 固相萃取（

8、 SPE）是一个包括液相和固相的物理萃取过程。在固相萃取过程中，固相对分析物的吸附力大于液相。当样品通过固相萃取柱时，分析物被吸附在固相表面，其它样品组分则通过柱子。分析物再用适当的溶剂洗脱下来，达到与样品基体和干扰化合物的分离及富集目的。 231.2 固相萃取的特点（1） 取代传统的液-液萃取，不需要大量互不相溶的溶剂；（2） 处理过程中不会产生乳化现象；（3） 采用高效高选择性的吸附剂 ，使萃取选择性高，重复性好；（4） 简化样品处理过程，减少费用。24保留 冲洗 洗脱样品基质 冲洗溶剂 洗脱溶剂1.3 固相萃取机制251.4 固相萃取过程分析物干扰物柱預处理样品添加柱洗涤分析物洗脫26固

9、相萃取的过程（1） 吸附剂的预处理 为保证萃取良好的再现现性，固相柱在使用前必须用适当的溶剂清洗。-对固相柱进行活化，展开碳氢链增加和分析物作用的表面积；-对固相柱进行清洗，除去柱上吸附的对分析有影响的物质加样前预处理好的柱子必须保持湿润27（2） 添加样品mL/min 。以离子交换为作用机理的萃取，速度要适当降低，以保证分析物有足够的时间与柱填料的离子交换官能团发生作用。28（3） 固相柱的洗涤 用适当的洗涤溶剂有选择性地将吸附力弱的杂质洗涤下来，而留分析物于柱上。（4） 固相柱的干燥 用自然或吹氮的方法使固相柱干燥。在非水溶性有机溶剂为洗脱剂或用GC分析时，柱的干燥尤为重要。29（5）分析

10、物的洗脱 选择适当的溶剂将分析物洗脱下来，用于分析或进一步处理。 洗脱溶剂应满足： A:必须有足够的强度，以最小用量将分析物洗脱下来； B:必须有足够的选择性，尽可能只将分析物洗脱，而将吸附力强的杂质留在柱上。301.5 固相萃取分离模式固相萃取分离模式与液相色谱相同（1）正相（ 吸附剂极性大于洗脱液极性）（2）反相（吸附剂极性小于洗脱液极性）（3）离子交换31（1） 正相萃取用极性吸附剂萃取极性物质。在正相萃取时目标化合物是否能够保留在吸附剂上，取决于目标化合物的极性官能团与吸附剂表面的极性官能团之间相互作用。包括氢键、键、偶极偶极、偶极诱导偶极相互作用以及其他的极性极性作用。正相固相萃取可

11、以从非极性溶剂样品中萃取极性化合物。 32（2） 反相萃取通常用非极性的或极性较弱的吸附剂萃取中等极性到非极性化合物。目标化合物与吸附剂间的作用是疏水性相互作用，主要是非极性非极性相互作用，是范德华力或色散力。 33（3） 离子交换萃取离子交换固相萃取所用的吸附剂是带有电荷的离子交换树脂，所萃取的目标化合物是带有电荷的化合物。目标化合物与吸附剂之间的相互作用是静电吸引力。341.6 吸附剂选择（1）根据目标化合物性质和样品基体性质。（2）尽量选择与目标化合物极性相似的吸附剂， 可以得到目标化合物的最佳吸附。（3）例如：萃取碳氢化合物时，采用反相固相萃取。当目标化合物极性适中时，正反相固相萃取都

12、可使用。35吸附剂选择考虑的其它因素（4）目标化合物在极性或非极性溶剂中的溶解度，这主要涉及淋洗液的选择； （5）目标化合物有无可能离子化（通过调节pH值），从而决定是否采用离子交换固相萃取；（6）目标化合物有无可能与吸附剂形成共价键，如形成共价键，在洗脱时可能会遇到麻烦；（7）非目标化合物与目标化合物在吸附剂的吸附点上的竞争程度，这关系到目标化合物与干扰化合物是否能很好分离。 36遵循“相似相溶”原则，并满足下列求：1）对被测组分溶解度大；2) 对干扰杂质的溶解度小；3）能有效释放被测组分；4) 具有良好地解离蛋白或脂肪的能力；5）沸点适中（4080）、黏度小、毒性低、易纯化、价格低廉、并易

13、于进一步净化处理。 1.8 洗脱溶剂的选择371.9 常见SPE柱类型极性柱：CN、NH2、PSA、 20H、Si-等；非极性柱：C18、C8、C2、CH、CN、PH阳离子交换柱：SCX，PRS，CBA阴离子交换柱：SAX，PSA， NH2，DEA 共价型柱：PBA根据目标化合物性质和样品种类，选用合适的SPE柱和淋洗剂38不同规格的SPE柱正相 (silica gel, almina, florisil, CN, NH2, Diol)反相(C18, C8, C4, Phenyl)离子交换(SAX, WAX, SCX, WCX)39 排放槽收集瓶SPE 柱SPE 柱預处理, 样品添加, 柱洗涤

14、40SPE 柱 排放槽收集瓶馏份洗脫41排放槽收集瓶SPE 柱HPLC 分析在线 HPLC 分析421.10 SPE应用复杂样品中微量或痕量目标化合物的分离和富集； 例如，生物体液（如血液，尿等）、中药及其代谢产物的分析、食品中有效成分或有害成分的分析、环保水样中有机污染 的分析的样品前处理。 43应用实例保健食品中人参皂甙的测定（1）样品处理：称量适量样品+水溶解 超声提取30min,定容，摇匀，放置。（2）层析柱：3mLXAD-2大孔树脂柱（聚芳烃微球）+中性氧化铝（100-200目）。（3）柱预处理：25mL 70%乙醇， 25mL 水。（4）进样：取1mL样品溶液进柱层析。（5）柱洗涤

15、： 25mL 水。（6）洗脱： 25mL 70%乙醇，收集，挥干。 44自动固相萃取仪控制器主机SPE柱试剂移液針注射泵样品45在线 SPE-HPLC分析462 凝胶净化法（GPC）2.1原理 根据多孔凝胶对不同大小分子的排助效应进行分离。 样品在多孔凝胶柱中随着流动相的移动，待分离的组分沿凝胶颗粒间的孔隙移动，大分子移动路径较短，先流出色谱柱，小分子由于扩散进入凝胶颗粒内部，迁移路径长，后流出色谱柱，实现分离。47GPC 的原理 利用空间排阻（分子尺寸大小）进行分离 小分子通过树脂“球”中的孔大分子不能从孔中通过 柱填料：Bio Beads S-X3(中性多孔的交联苯乙烯二乙烯基苯聚合物)4

16、82.2 凝胶色谱仪利用凝胶渗透色谱（排阻色谱）的分离原理制造的商品化仪器。泵 流动相 样品 凝胶柱 组分分离 大分子先流出 弃掉 小分子目标化合物后流出 收集49GPC 样品净化系统-手动手动样品净化系统50GPC 样品净化系统-全自动控制系统（可编程控制软件）自动进样 / 馏分收集系统柱子 溶剂输送泵UV检测器进样阀及柱通路阀512.3 影响GPC分离效果因素1）分子的形状和体积（2）芳烃类化合物 (包括多环芳烃)由于与柱填料聚合物之间形成pi-pi健，所以洗脱时间较长。（3）不同的溶剂系统对凝胶的溶胀作用不同，所以采用不同的溶剂系统会得到不同的分离结果。52 固相微萃取(Solid Ph

17、ase Microextraction） 固相微萃取(SPME)是九十年代兴起并迅速发展的新型的、环境友好的样品前处理技术，无需有机溶剂，操作简便。在一个简单过程中同时完成了取样、萃取、富集和进样，是对液体样品中痕量有机污染物萃取方面的重要贡献。533.1 固相微萃取原理吸附-在石英纤维萃取头外表面涂渍一层固定液。遵循相似相溶原理，待测物在一定条件下被溶解/吸附在固定液中，并在固定液和样品中介质中达到平衡。涂层上吸附的待测物的量与样品中待测物浓度线性相关。 解吸采用热解吸GC测定。 543.2 SPME特点（1）无需溶剂直接提取水溶液和固体基质中的挥发性和半挥发性化合物（2）不同吸附纤维满足多

18、种应用需求（3） 配合自动进样器使用，保证实验的精确度和准确性（4） 可取代其他样品浓缩技术（5） 经济：每个萃取头可以反复使用50次以上。（最多达200次左右）553.3 固相微萃取的分类（1） 直接固相微萃取（ Direct-SPME ）： 将涂有高分子固相液膜的石英纤维直接插入样品溶液或气样中，对目标分析物进行萃取。经过一定时间达到分配平衡，即可取出进行色谱分析563.3 固相微萃取的分类 （2） 顶空固相微萃取法（HS-SPME）： 石英纤维停放在样品溶液上方进行顶空萃取，不与样品基体接触，避免了基体干扰，同时提高了分析速度。57583.4 固相微萃取的操作步骤（1） 样品萃取 将SP

19、ME针管穿透样品瓶隔垫，插入瓶中。 推手柄杆使纤维头伸出针管，纤维头可以浸 入水溶液中（直接萃取）或置于样品上部空间（顶空方式），萃取时间大约2-30分钟。 缩回纤维头，然后将针管退出样品瓶。593.4 固相微萃取的操作步骤（2） GC 分析 将SPME针管插入GC 仪进样口。 推手柄杆，伸出纤维头，热脱附样品进GC 色谱柱。 缩回纤维头，移去针管，完成全过程。603.5 SPME技术关键固相微萃取关键在于选择石英纤维上的涂层（吸附剂）。要使目标化合物能吸附在涂层上，而干扰化合物和溶剂不吸附。一般原则是：目标化合物是非极性时选择非极性涂层；目标化合物是极性时选择极性涂层。 61其它影响因素：（

20、1）液膜厚度及其性质的影响：石英纤维表面的固相液膜厚度对于分析物的固相吸附量和平衡时间都有影响。液膜越厚，固相吸附量越大，有利于提高方法灵敏度。62 （2） 搅拌效率的影响：HS-SPME方法中分析物由液相向气相扩散仍是最慢的一步。通过搅拌，加快分析物由液相向气相扩散的速度，使顶空区分析物浓度增大，快速达到平衡。可提高分析的灵敏度。63 （3）温度的影响： 温度升高， 扩散速度随之增大，同时升温加强了对流过程，因此升温有利于缩短平衡时间，加快分析速度。在使用SPME方法时应寻找最佳工作温度。64（4） 盐的作用：在气相和液相间的分配系数 K 受基体性质的影响，当基体变化时，分配系数也会改变。

21、在水溶液样品中加入盐（NaCl、Na2SO4等）后，水溶液的离子强度增大， K增大，使分析物在水相中溶解度减小，在气相中浓度增大。 （5） 溶液pH值的影响 控制溶液pH值能够改变溶液的离子强度，也能改变有机物在水中的溶解度。653.6 SPME应用SPME在食品与生物样品上应用日趋增加。 如：人乳中PCB 及DDTmlml高氯酸（1M）g硫酸钠。顶空瓶密封后振荡混匀，置加热块上加热，搅拌。SPME纤维（涂渍85um polyacrylate）在顶空瓶里的气相中静置40min。萃取完成后吸附纤维插入GC进样口（280）10分钟使目标物从纤维上热解吸，色谱分析(GC-ECD或 GC-MS)。66

22、自动SPME装置Incubator for heating and mixingMoving syringe holderSample tray674 液相微萃取（ LPME） 为解决传统液液萃取的不足，如：烦琐、费时、污染环境、危害操作者，人们开始研究一种新的提取方式液相微萃取（Liquid phase microxraction ）。 液相微萃取简单的说就是用极少量的溶剂提取液体样品中的目标化合物。样品状态通常为水或水溶性的生物材料。方法的特点是有机溶剂用量少，操作简便。68 4.1液相微萃取二种方式：（1） 单滴微萃取（ SDME ）（Single Drop microxraction）

23、单滴微萃取：是将萃取液直接接触样品溶液或悬于样品顶部空间，使目标化合物从水相中转移至有机相（萃取溶剂）中，然后分析萃取溶剂。 69操作方法：用一个注射器装上萃取溶剂，插在装有样品的密闭萃取瓶中。推出一滴溶剂，并使溶液悬挂在针尖上，保持不掉下去，萃取瓶下面可以加热，也可以搅拌，使样品中的目标化合物逸出，进入上部空间，溶解在萃取液中。时间要足够长，操作条件要一致，使目标化合物在几相中达到动态平衡。然后，将液滴抽回到注射器中，进行GCLCGC-MS分析。 70（2）中空纤维膜液相微萃取（LPME-HFM） 由于悬滴液的物理稳定性差，比如，脱落，挥发，分散。所以人们又开始研究改进，产生了中空纤维膜液相

24、微萃取法。 （ Liquid phase microxraction supported by hollow fiber membrance）714.2 中空纤维是上世纪发展起来的八大纤维之一，主要有聚砜类、纤维素类、聚烯烃类等。这些材料的膜具有多孔的特点，孔径在m之间，根据需要可以截留纳米级到微米级以上的颗粒，能够除去水中、空气中以及其他低粘度流体中的细菌。目前主要应用于饮料、食品、电子、医药、化工等行业，特别是在民用净水行业，用途尤为广泛。 724.3 分析工作者利用中空纤维膜的可渗透性，将这一新材料用于水相样品中有机物的萃取。其做法：是将萃取液放在中空纤维膜中包裹起来，多孔纤维作为样品和

25、和萃取溶剂的界面，避免两相的直接混合。在水相中的目标化合物透过纤维的微孔，进入并溶解在有机萃取液中，从而达到萃取浓缩的目的。 734.4 研究实例 中空纤维膜液-液萃取气相色谱法测定体液中曲马多（1）取样：自来水、尿、血浆等4mL,加1L内标物（度冷丁1 mg/mL），加0.1 mL 1M NaOH，于6 mL萃取瓶中。放入磁性转子，于磁力搅拌器上。（2）萃取装置：中空纤维膜（聚偏氟乙烯类）外径mm, 内径mm，膜壁平均孔径m。截取2cm长，清洗，干燥。用微量注射器抽取4L甲苯（萃取液），注如入到中空纤维膜内，将另一端融封。74（3）将萃取装置插入萃取池中，室温下搅拌萃取15分钟。（4）测定：

26、萃取结束后，剪开融封端，抽取1L萃取液进GC测定。（5）影响萃取的因素：萃取溶剂种类；萃取时间；搅拌速度；样品酸度。（6）方法优点：有机溶剂用量少，环保；操作简单，快速；装置简单，经济；尤其适合样品量少的情况。755 加速溶剂萃取（ASE）原理：根据待测物对有机溶剂具有较高的亲合力，通过增加温度（50200）和压力提高（1500-2000psi） 将待测物从固体、半固体的样品中萃取到有机溶剂中。76增加温度和提高压力的作用 在高温和高压下提取样品，其操作温度比索氏提取高，从而使溶剂具有更强的溶解能力。高温还可以减弱组分与样品基质的结合，降低溶剂的黏度，使溶剂更容易渗透到样品内部。高压可以提高扩

27、散系数和传质速度，从而提高组分向溶剂转移的速度。77快速、有效的样品处理方法 装置示意图24个样品连续自动萃取样品池内体积1、5、11、22和33毫升每个样品常规萃取时间15分钟左右使用萃取溶剂体积10-50毫升785.3 ASE特点溶剂用量少萃取效率高快速减少人为误差样品基体影响小可进行全自动萃取79SolventOvenCollection VialVentExtraction CellPump将样品装入萃取池 Time(min)0.512121455溶剂充满萃取池 0-1萃取池加热加压样品保持一定的压力和温度 (静态萃取）向萃取池中注入清洁溶剂用N2 吹扫萃取池.萃取液准备分析.Tota

28、l80溶剂萃取技术的比较技术样品大小(克)溶剂体积(毫升)溶剂/样品平均萃取时间（小时）索氏提取超声提取微波萃取分液漏斗自动索氏ASE10-30305501010-30300-500300-400303005015-4516-3010-136651.54-480.5-10.5-11-412-20min81ASE技术与索氏提取的比较ASE萃取溶剂量小10-15ml萃取时间短 10-15min全自动对同一样品一次可自由选择溶剂进行多次萃取可萃取含水份样品索氏提取溶剂量大500ml以上萃取时间长 4-48小时不能自动控制对同一种样品一次只能一种溶剂选择方案不能萃取含水份样品82ASE技术与固相萃取的

29、比较ASE萃取处理的对象是固体萃取过程是溶解过程固相萃取处理的样品是液体萃取过程是吸附解析过程83ASE的应用领域环 境农业、食品聚合物 制 药84小麦中28种农药残留的萃取农残组分 （部分） 回收率有机磷类Parathion（对硫磷） Diazinon氯化类 Endosulfan-alpha Endosulfan-beta除草剂 Trifluralin 101.296.994.193.399.685ASE萃取挥发性物质的回收率化合物 Avg. (%) RSD (%)86 6 超临界流体萃取（SFE）超临界流体具有类似气体的较强穿透力和类似于液体的较大密度和溶解性，具有良好的溶剂特性，由于具有特殊的物化性质，被作为溶剂萃取样品中的某些目标化合物。SFE利用超临界流体为萃取剂的萃取技术。 876.1 超临界流体萃取特点SFE提取速度快，效率高、选择性强、避免大量溶剂的使用，且易于净化。886.2 超临界流体萃取应用通常采用二氧化碳作为SFE流体，萃取非极性和中等极性的物质。对于样品分子含有羟基或羧基等极性基团，需要在二氧化碳中加入适量的极性溶剂，以提高流体的极性，或采用极性的超临界流体，如：氨等。用二氧化碳为流体时，操作温度低，有利于热不稳定化合物的萃取，同时，流体中不含氧，避免了组分的氧化。89二恶英的超临界流体萃取将适量样品与