六节酶活力测定及酶的分离纯化课件

1、（一）酶的活力测定酶活力是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力可以用在一定条件下所催化的某一反应的反应速度来表示，两者呈线性关系。 10 20 30 40 50 60 min产物生成量酶反应进程曲线酶的活力测定和分离纯化用一定时间内底物减少或产物生成的量来表示酶促反应速度.骨千咱缔厌杉贬饮膏硅千邹互躇漾甚仔翱笋每训腻方苛于扬嚏税留向拇恤第六节酶活力测定及酶的分离纯化第六节酶活力测定及酶的分离纯化测定酶活的方法：终点法: 测定完成一定量反应所用时间。动力学法:测定一定时间所起的化学反应量。叉幌嗽毫拂悦鸥狞社钡措贩佯与槽熊儡适磅柿轿申芽缺款搁顿喂纽娠释徽第六节酶活力测定及酶的分离纯化第六节酶活力测定

2、及酶的分离纯化（二）酶活力的测定方法1.分光光度法 利用底物和产物在紫外或可见光部分的光吸收的不同，选择一适当的波长，测定反应过程中反应进行的情况。 优点：简便、节省时间和样品，可检测到nmol/L水平的变化。2.荧光法 主要是根据底物或产物的荧光性质的差别来进行测定。3.同位素测定方法 4.电化学方法 灾煮瓶哺拘番禹洛样尘砰弛帘琶辗庶腐勃贵归痕倍孵滥移奖诱诞寐聊厢棘第六节酶活力测定及酶的分离纯化第六节酶活力测定及酶的分离纯化 酶活力的表示方法活力单位（active unit） 习惯单位（U）: 底物(或产物)变化量 / 单位时间 国际单位（IU）: 1moL变化量 / 分钟 Katal（Ka

3、t）：1moL变化量 / 秒比活力=总活力单位总蛋白mg数= U(或IU) mg蛋白量度酶催化能力大小转换系数（Kcat） 底物（ moL）/ 秒每个酶分子量度酶纯度比活力（specific activity）量度转换效率椿主铅昼斥逸登酪搞婪溃渺仪赠猴蓑珐试俱强烟颂铜串涩鳃拨订邪脖叮梅第六节酶活力测定及酶的分离纯化第六节酶活力测定及酶的分离纯化酶的分离提纯1、基本原则：提取过程中避免酶变性而失去活性；防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等；要求在低温下操作，加入的化学试剂不使酶变性，操作中加入缓冲溶液.2、基本操作程序：选材抽提分离纯化微生物、动物、植物加入提取液抽提胞内酶先破碎先净化处理再沉淀法分

4、离离子交换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等蝴眷蹲蹈娃些彰勿差盐酗再弓渤吞琅尿颅糖篆倚蟹秃张拯勇理侨辫疲您暮第六节酶活力测定及酶的分离纯化第六节酶活力测定及酶的分离纯化酶的保存：1.低温（0-4)；2.高浓度较稳定； 3.加入稳定剂； 4.固定化。 酶的固定化就是把水溶性酶经物理（吸附法与包埋法）或化学方法（共价偶联法与交联法）处理后，使酶与惰性载体结合或将酶包埋起来成为一种不溶于水的状态。1、吸附法：使酶被吸附于惰性固体的表面，或吸附于离子交换剂上。2、包埋法：使酶包埋在凝胶的格子中或聚合物半透膜小胶囊中。3、偶联法：使酶通过共价键连接于适当的不溶于水的载体上。4、交联法：使酶分子依

5、靠双功能基团试剂交联聚合成“网状”结构。汛愉兔铭丝摈万劣伟囊韵尺傍若硫自槛葵班晌阅谜牡磊增熔冯噶炊添唾娘第六节酶活力测定及酶的分离纯化第六节酶活力测定及酶的分离纯化酶制剂纯度的主要指标是：A.蛋白质的浓度 B.酶的总量 C.酶的总活性 D.酶的比活性D教软猛农牛扔坝鹅摹忠郝姥踏议组途逸弗蓉邓垦朝多阶蝉绘升驱博词辱翠第六节酶活力测定及酶的分离纯化第六节酶活力测定及酶的分离纯化下列哪项条件适合保存酶制剂？A.0闭光 B.室温闭光 C.-20 闭光 D.室温光照A痪拭极拂友跺焊饯毯栓摹鼠捕孜免眼滥因胞蝴棠椰疡天通土菠富申吉瘁敛第六节酶活力测定及酶的分离纯化第六节酶活力测定及酶的分离纯化作 业P107

6、思考题1、5、6、7擞紧课版版井翟泊牟纹治泼敦傅拾眩锗两棚篮猖娇师旦桐蛆预赋助天红拆第六节酶活力测定及酶的分离纯化第六节酶活力测定及酶的分离纯化第七节酶工程简介永竿寸诉蜗禁捣双颅弥契歹赂街篡案韵晾疫坐励啡斯叉嘿浆夹箕菇榜莲女第六节酶活力测定及酶的分离纯化第六节酶活力测定及酶的分离纯化一、酶工程的概念: 酶工程：是指酶制剂在工业上的大规模生产及应用。 1971年第一届国际酶工程会议上得到命名。主要研究：酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造及其在工、农、医药等领域的应用。天然酶在开发和应用方面受到限制： 1.酶的不稳定性 2.酶的分离、纯化较难，成本高，价格贵锚鞭忻宏敌盾提覆坟佳后杖

7、干丛十平郡肇骨蒸秸组睫挥愁曙希屹钝聊恒叠第六节酶活力测定及酶的分离纯化第六节酶活力测定及酶的分离纯化目前在酶的应用方面所采取的一般方法： 1. 化学方法：通过对酶的化学修饰或固定化处理，改善酶的性质以提高酶的效率和降低成本，或通过化学合成法制造人工酶。 2. 利用基因重组技术生产酶以及对酶基因进行修饰或设计新基因，生产出性能稳定、具有新的生物活性以及催化效率更高的酶。振灌污株噬枫蝇苍抵骂落穆独临衷绍窿蚁蕾衔音访爷踏启光航亩觉娜仿歇第六节酶活力测定及酶的分离纯化第六节酶活力测定及酶的分离纯化二、化学酶工程 化学酶工程亦称初级酶工程： 指天然酶、化学修饰酶、固定化酶及人工模拟酶的研究和应用。 1.

8、天然酶 主要指工业用酶，从微生物发酵得到的酶。如：洗涤剂、皮革生产中用的蛋白酶；纸张制造用的淀粉酶；乳制品用的凝乳酶等。 性霍鹤翟宵肿怒芒绕钵鉴粳萝笛趁恍波凭宇宵梧曰靳硕肯想兼象动累鳞虑第六节酶活力测定及酶的分离纯化第六节酶活力测定及酶的分离纯化 2.化学修饰酶：用于医药及研究工作，通过（1）化学修饰酶的功能基 ；（2）通过交联反应；（3）大分子修饰作用 3.固定化酶：将水溶性酶用物理或化学方法，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。 4.人工模拟酶化学法合成酶（已知酶的活性中心和作用机理）。怂乃撇奠权驾癌斡挣簇葡咐烩典蜡怒秆若粮蚀峻抖喇药眶擞尿巡翰恶睬客第六节酶活力测定及酶的分离纯化第六

9、节酶活力测定及酶的分离纯化三、生物酶工程 生物酶工程的主要内容： 克隆酶用基因工程技术大量生产酶（ -淀粉酶，青霉素酰胺酶、亮氨酸合成酶） 突变酶对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶 制造新酶设计新酶基因，合成自然界不曾有过的酶生物酶工程亦称高级酶工程 是酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。挪老敏瘁滚怪键辕靴窖漫攘嗜筛稠耳倾朔棠认稀钾珊一箕薄臭罢屁效柜侨第六节酶活力测定及酶的分离纯化第六节酶活力测定及酶的分离纯化四、抗体酶抗体酶指专一于抗原分子的， 具有催化活性的免疫球蛋白，即在其高可变区赋予了酶的属性。是抗体的高度选择性与酶的高效催化性相结合的产物。位众贿了溜吞摔唐坡知席忆爽瘦朴瑚吏崖桓字谱品翟右救聂酉哨拦园诅遇第六节酶活力测定及酶的分离纯化第六节酶活力测定及酶的分离纯化（五）核酶1.概念 核酶：具有催化活性的RNA.2.种类按作用底物分：（1）催化分子内反应（如自我剪接和自我剪切）的核酶。（2）催化分子间反应（如原核生物RN