微生物学课件：4 革兰氏阴性球菌的分类鉴定

1、革兰氏阴性球菌的分类鉴定在临床微生物学中，需氧生长的革兰氏阴性球菌只有一个科，即奈瑟氏菌科。奈瑟氏菌科包括5个属，即：奈瑟氏菌属、布兰汉氏菌属、莫拉氏菌属、不动杆菌属和金氏杆菌属。 奈瑟氏菌属与布兰汉氏菌属之间，在菌体的形态、大小、排列方式、染色反应等方面基本上是一样的；在血琼脂和巧克力色血琼脂上的菌落形态基本相同；在生化反应方面，两菌之间亦极为相似。但从人体能够分离出的布兰汉氏菌属只有一个种，即卡它尔布兰汉氏菌，它与奈瑟氏菌属的主要区别点就在于卡它尔布兰汉氏菌DNA酶阳性；而奈瑟氏菌属的所有种，DNA酶均为阴性。据此，可资鉴别。一、卡它尔布兰汉氏菌本菌的归属和命名曾几度被更改。最初被称为卡它

2、尔微球菌；上个世纪60年代被命名为卡它尔奈瑟氏菌；70年代根据DNA同源性的研究，被独立分为一属，即布兰汉氏菌属。79年后国际微生物学界部分学者建议将本菌划归于莫拉氏菌，成为卡它尔莫拉氏菌。近年来，国际上一些权威微生物学著作如伯杰氏细菌鉴定手册第九版将其归属于莫拉氏菌属布兰汉氏亚属，但习惯上仍将其称为布兰汉氏菌属。该属只有一个种：卡它尔布兰汉氏菌。卡它尔布兰汉氏菌为革兰氏阴性小球菌，无鞭毛，不运动，单个或成双排列，相邻面稍平坦。该菌在血琼脂和巧克力平板上生长良好，菌落呈灰白色，不透明、圆形、突起、表面干燥。510%的CO2环境有助于该菌的生长。本菌对低温的耐受性比其它奈瑟氏菌属细菌强，能在28

3、以下生长。触酶及氧化酶阳性,DNA酶阳性。卡它尔布兰汉氏菌是人类和其它温血脊椎动物上呼吸道粘膜的正常菌群之一，在幼年和老年人群中多见，而健康成人中少见。近十年来的临床观察和研究证实，本菌是导致1015%中耳炎、鼻窦炎病例的病原菌，且常引起老年病人的下呼吸道感染，尤其常见于慢性肺气肿和肺心病患者，临床实验室在处理这类病人的呼吸道标本时，应重视本菌的分离和鉴定。二、奈瑟氏菌属（Neisseria）的分类鉴定（一）、奈瑟氏菌属的主要特性：奈瑟氏菌属是一群革兰氏阴性球菌，菌体呈肾形，通常成双排列，即凹面相对、突面相背，宛如螺丝帽状。该菌属无鞭毛、无芽孢，具有严格的寄生性。除淋病奈瑟氏菌存在于患者的泌尿

4、生殖道粘膜外，其它常寄生于人的鼻咽腔。该菌属中的致病菌营养要求较高，在普通培养基上不生长或生长极为不良，在含血液或血清的培养基上生长良好；对环境温度和生长条件要求也较高：低于30，高于40即不能生长；初次分离需提供510%的CO2环境才能生长。该菌属细菌特别是病原菌发酵糖类的能力较弱，氧化酶、触酶均为阳性，DNA酶阴性，此为该菌属的共同特性。（二）、奈瑟氏菌属的分类：根据目前的分类，国际上公开承认的奈瑟氏菌属共有十个种，即：脑膜炎奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌、解（嗜）乳糖奈瑟氏菌、灰色奈瑟氏菌、多糖奈瑟氏菌、微黄奈瑟氏菌、干燥奈瑟氏菌、粘液奈瑟氏菌、浅（变）黄奈瑟氏菌、延长奈瑟氏菌。（三）、 脑膜炎

5、奈瑟氏菌（N. Meningitidis）脑膜炎奈瑟氏菌（俗称脑膜炎球菌）是流行性脑脊髓膜炎（流脑）的病原菌。人类是该菌的唯一宿主。该菌系1884年由马契法伐（Marchiafave）与西利（Celli）两氏于脑脊髓膜炎患者之脑膜渗出液中首先发现，后于1887年由威希塞巴姆（Weichselbaum）氏于六例脑脊髓膜炎患者之脑脊液中分离获得此菌之纯培养。1、 生物学性状（1）、形态与染色：脑膜炎奈瑟氏菌为革兰氏阴性双球菌。单个菌体呈肾形，凹面相对、突面相背、成双排列，宛如螺丝帽状。该菌无鞭毛、无芽孢，部分菌株可形成荚膜。该菌幼龄菌菌体形态圆整，衰老菌易呈多形性。在脑脊液涂片中，本菌常位于中性粒

6、细胞内外，形态典型，对流脑具有诊断意义；经人工培养的细菌，形态多呈卵圆形或球形，排列不规则、菌体大小不等。如培养过久，培养物涂片所见细菌常呈衰退或膨大的球状，着色不均匀，这与细菌本身的自溶酶有关。（2）、培养特性脑膜炎奈瑟氏菌为专性需氧菌，初次分离时需510%的CO2环境才能生长，这是因为该菌在生长过程中能分解培养基中的某些含氮物质产生氨，氨对该菌有杀灭作用，而CO2能中和细菌所产生的氨，以减少对细菌的毒性。故初次分离需提供CO2环境。该菌娇弱易死，对温度要求很严，低于30，高于40即不能生长，其最适生长温度为3537；最适pH为7.47.6。脑膜炎奈瑟氏菌对营养要求较高，在普通培养基上不能生

7、长，需在含有血液、血清或卵黄的培养基中才能生长。这是因为该菌对蛋白胨和琼脂中所含的毒性酸类和微量金属敏感，这种抑制物可通过加入的血液、血清与之结合而被除去，也可将培养基中加入适量玉米粉、山芋粉等不溶性淀粉将毒性物质吸附掉。临床上常用巧克力色血琼脂平板来分离标本中的脑膜炎奈瑟氏菌。但该培养基对鼻咽腔分泌物却不太适用。这是因为鼻咽腔中菌群复杂，往往影响该菌的检出。为了解决这一问题，临床上又常采用卵黄双抗平板（EPV）作为本菌的选择性培养基。由于该培养基含有一定量的多粘菌素B及万古霉素，故可抑制革兰氏阳性菌和其他阴性细菌，同时选择性地使脑膜炎奈瑟氏菌生长，从而提高检出率。脑膜炎奈瑟氏菌在巧克力平板上

8、经37，1824h培养后，呈无色或灰白色、半透明、圆形突起、光滑湿润，呈露珠状之小菌落。在血平板上无色素、不溶血、较柔软、易乳化。在卵黄双抗平板上，呈无色、较大、圆形扁平、光滑湿润、中央稍浑、边缘透明之菌落。培养该菌时应注意：由于该菌具有自溶酶,培养过久易发生自溶现象，因此，应及时传代，以免菌体自溶。另外还应注意，由于自溶酶的存在，在做试管凝集试验时不能用活菌，必须加入杀菌剂如福尔马林或用加热的方法使自溶酶破坏，以免菌体很快裂解而影响试验结果。（3）、生化反应 本菌绝大多数能分解葡萄糖和麦芽糖产酸不产气；不分解乳糖、甘露醇、半乳糖、果糖和蔗糖；不水解蛋白质；不产生H2S ；不形成靛基质；不分解

9、尿素；也不凝固血清及牛乳；氧化酶阳性，硝酸盐还原试验阴性。此外，脑膜炎奈瑟氏菌可产生一种胞外酶，即谷氨酰氨基肽酶，可与淋球菌相区别。（4）、抗原构造与血清学分型脑膜炎奈瑟氏菌主要有如下三种抗原：、核蛋白抗原：为细菌的内毒素，抗原性较弱，无特异性，与肺炎链球菌菌体核蛋白抗原相同。、细胞壁多糖抗原：无特异性，与其它奈瑟氏菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌的某些菌株的抗原相同。、荚膜多糖抗原：又称型特异性抗原。具有特异性。各型之间互不相同。国际上（世界卫生组织）根据荚膜多糖抗原的不同，利用凝集反应及琼脂扩散试验，将脑膜炎奈瑟氏菌分为10个血清群，即：A、B、C、D、L、X、Y、Z、29E、W135。19

10、75年，我国丁绍卿等利用凝集素吸收试验和间接血凝试验发现了7个新的血清群，分别命名为：1889、1890、1892、319、1916、1486和1811群。 其后对新的血清群抗原进行分析，证实1889、1892、319和1916群与国外报告的Y、29E、W135和X群相同，而1890、1486和1811群迄今为止国外尚未报导，为此，我国现在将这三个群命名为H、I、K群。 总之，把国际和国内的分群方式结合起来，我们可以发现脑膜炎奈瑟氏菌目前共有13个血清群。我国流行的主要是A群（从流脑患者CSF中分离到的脑膜炎奈瑟氏菌，A群占95%），而在欧美流行的主要是B群和C群。2、 致病性与免疫力经流行病

11、学研究，人们发现，正常人群的带菌率可达4080%。这就说明脑膜炎奈瑟氏菌寄生于正常人的鼻咽腔内可不引起任何症状，但这种带菌者确是流脑流行的重要传染源。 该菌一般经飞沫传染，潜伏期14天。其发展过程可分为三个时期，即、呼吸道感染期：细菌首先侵入鼻咽腔，引起上呼吸道感染，有时局部表现为炎症反应；、菌血症期：少数细菌侵入血流，造成单纯菌血症，病人可有突然发生的恶寒、发热、恶心、呕吐等，并可在皮肤表面出现淤血点；、脑膜炎期：大量细菌侵入血流后，经血液或淋巴到达脑脊髓膜，引起脑脊髓膜炎并出现相应的体症，如头痛、发热、呕吐、颈项强直、颅压增高等，同时，脑膜炎奈瑟氏菌可相继存在于鼻咽腔、血液、淤血点及脑脊液

12、中。 动物实验发现：以致死量的活菌注射入小白鼠体内，其内脏很少查到细菌。用脑膜炎奈瑟氏菌的活菌悬液注射动物引起动物死亡的量，和死菌悬液注射动物引起动物死亡的量相近。这说明脑膜炎奈瑟氏菌的致死作用可能是由于细菌侵入机体后，因死亡或自溶后放出内毒素所致。内毒素对血管系统的侵害极大，可引起坏死出血，皮内毛细血管出血时，形成出血性皮疹。人对本菌的抵抗力较大，感染后仅23%的人表现为脑膜炎，绝大多数则为鼻咽炎或带菌状态。感染后的病人或带菌者体内可有群特异性抗体上升，如凝集素、沉淀素、溶菌素等，能促进吞噬作用和溶菌作用。一般认为病后可产生一定的免疫力，但并不持久。3、 微生物学检查法（1）、标本采集：根据

13、不同病程、不同临床症状采集不同标本。一般常用的标本是：鼻咽腔分泌物、血液、淤血点、脑脊液。（2）、检验程序及方法（3）、脑膜炎奈瑟氏菌的判定标准、涂片染色镜检，形态染色必须典型；、菌落与菌苔必须典型，不产生色素；、在生理盐水中无自凝现象；、糖发酵反应：葡萄糖+；麦芽糖+；蔗糖；、普通琼脂斜面；37，510%的CO2环境， 24h不生长；、巧克力色血琼脂斜面，22，24h不生长；、玻片凝集反应，应与分群血清凝集。（4）、有关免疫学诊断技术、荧光抗体试验：这种方法是用荧光物质（如罗丹明或异硫氰酸盐）标记的荧光抗体来检查涂片中的脑膜炎奈瑟氏菌。方法是：将标本涂片用多价脑膜炎奈瑟氏菌荧光抗体染色，并在

14、荧光显微镜下检查。若出现典型双球菌或肾形发光的菌体即为阳性。这种方法快速、准确，在1h内即可获得结果，阳性率与培养法相近，适于做带菌者的大量普查。但需特殊的荧光显微镜和荧光抗体，故一般实验室难以开展。 、 间接血凝试验：脑膜炎奈瑟氏菌和其它细菌一样感染机体后可刺激机体产生相应的抗体。而间接血凝试验就是用人工提纯的脑膜炎奈瑟氏菌的多糖抗原来测定标本中相应抗体的。抗原 + 相应抗体 凝集但由于在该试验中，抗原是可溶性抗原；抗体的量又很少，故不会出现凝集现象。为提高检测结果的敏感性，人们可以借助于绵羊红细胞来进行间接凝集试验。 、反向间接血凝试验：反向间接血凝试验是用吸附有抗体分子的红细胞去检查相应

15、的抗原。 （四）、淋病奈瑟氏菌 （N. gonorrhoeae） 淋病奈瑟氏菌是“淋病”的病原菌，通称“淋球菌”。为严格的人体寄生菌。常存在于急、慢性尿道炎与阴道炎的脓性分泌物中以及新生儿的眼结膜分泌物中。淋球菌最早系由Neisser氏於1879年在淋病患者病灶之脓细胞中发现；1882年列斯脱高夫（Leistikow）氏首先获得该菌之纯培养；1885年勃姆氏（Bumm）将纯培养物接种于人体而引起淋病感染，进一步证实了此菌为淋病之病原菌。1、 生物学特性（1）、形态与染色本菌的形态与脑膜炎奈瑟氏菌很相似，呈球形或肾形，成双排列，形似一对“黄豆”或成螺丝帽状。革兰氏阴性，无芽孢、无鞭毛，有荚膜。在

16、急性淋病患者尿道脓汁标本中可见细菌被吞噬于嗜中性粒细胞内；慢性淋病时多在细胞外。（2）、培养特性本菌营养要求高，需用巧克力色血平板、或含万古霉素、多粘菌素及制霉菌素的ThayerMartin培养基上才能生长。初次分离需供给510%的CO2环境；最适生长温度为3537，低于30即不能生长。最适pH7.5。经48h培养可形成灰白色、不透明、圆形、突起、细小颗粒状菌落，进一步培养，菌落可呈粘液状。 （3）、生化反应：生化反应能力弱，只分解葡萄糖产酸不产气；不分解麦芽糖、蔗糖和乳糖；靛基质、H2S、硝酸盐还原、DNA酶；氧化酶及触酶试验均+。（4）、抵抗力：本菌抵抗力极弱，对冷、热、干燥及常用消毒剂均

17、敏感。经干燥12h或加热555min即可杀死。多数菌株对磺胺、青霉素、土霉素、红霉素和氯霉素均较敏感，但易产生耐药性。由于该菌娇弱易死，对温度变化十分敏感，故在培养该菌时，须将培养基预温至3537，否则，易造成该菌死亡。2、 致病性人类是淋病奈瑟氏菌的唯一宿主。淋病奈瑟氏菌的致病因素与荚膜和菌毛有关。荚膜可增强该菌的抵抗力和侵袭力；菌毛有吸附宿主上皮细胞的作用，使淋病奈瑟氏菌易于侵入泌尿生殖道粘膜，并迅速生长繁殖引起疾病。淋病奈瑟氏菌主要通过直接接触传染，也可通过污染的被褥、衣物、用品传染。男性发生急性尿道炎、前列腺炎和附睾炎，出现尿急、尿痛、尿道堵塞现象；尿道口可排出大量脓性分泌物。女性感染后多无症状或仅有少量分泌物，若淋病奈瑟氏菌侵入尿道、阴道并延伸到子宫颈与输卵管，可引起盆腔炎和输卵管炎。淋病奈瑟氏菌还可侵入血流造成机体其它部位化脓性炎症，如关节炎、心内膜炎以及菌血症新生儿通过患淋病母体的产道，引起新生儿眼结膜炎。 3、微生物学检查法（1）、标本采集男性病人：尿道炎时先以无菌盐水冲洗尿道口，采取尿道脓性分泌物；前列腺炎时以前列腺按摩方式采集标本。女性病人：尿道炎：先清洗尿道口，然后从阴道后壁，从后向前方压迫尿道，使分泌物排出，用接种环或棉拭采集之。 宫颈炎：先用阴道窥镜充分暴露子宫颈部，清洗宫颈口、阴道壁，用无菌棉拭采集分泌物。阴道炎：借助阴道窥镜用