2011级硕士实验课 ELISA

1、免疫学实验课1第二次实验课酶联免疫吸附试验 2间接法ELISA实验原理EEE已知抗原包被酶标板加入未知抗体（一抗）加入酶标抗体（二抗）加入底物，显色封闭洗板洗板3实验分组每组一块40孔的酶标板每人一行4实验试剂与器材试剂：封闭液(1%PBS-BSA) 7ml洗液(PBS-Tween20) 1瓶抗OVA抗体 2支酶标抗体(HRP-GaM) 5ml底物 5ml终止液(H2SO4) 2.5ml器材：酶标板 1块200l pipette 1把1000l pipette 1把Tip (大/小) 若干1.5ml EP管 若干培养箱37 1个吸水纸 若干5包被：用0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原

2、(OVA，10g/ml)稀释。100 l/well加入聚苯乙烯酶标板中，4 over night。次日，弃去孔内溶液。封闭：加入150 l/well 1%PBS-脱脂奶粉，37 for 40mins。加一抗：弃去封闭液，加倍比稀释的抗体100 l/孔（稀释与加板方法见后) 37孵育40mins ；孵育结束后，用PBS-T洗三次。 酶抗：酶标抗体 (HRP-羊抗鼠IgG)，100l/well ，置37孵育40mins，用PBS-T洗三次。显色：于各反应孔中加入新鲜配制的底物溶液100l/well。 终止：加50 l/well2M硫酸(终止液)。(altering the pH) 判定： 肉眼观察

3、：与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔，相对应的抗体稀释度为该抗体的效价。酶标仪测量： 490nm滤光片下测光吸收值(A)，与阴性对照A值相比其比值2，相对应的抗体稀释度为该抗体的效价。 实验步骤6包被固相支持物：聚苯乙烯和聚氯乙烯有较强的非特异性物理吸附蛋白质的特性，被吸附的蛋白质的免疫学活性不发生改变（Ag-Ab结合）包被缓冲液：碳酸盐缓冲液（pH9.6）磷酸盐缓冲液（pH7.2） Tris-HCL缓冲液（pH7-8）包被温度、时间：4 18-24小时包被抗原浓度：10ug/ml7封闭的作用包被时所用的抗原或抗体浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白

4、质充填这些空隙，从而防止非特异性吸附，影响结果的准确性。如图：8CoatingBlockingEEEEAfter blockingAfter blockingEEWithout blocking封 闭 的 作 用9最常用的封闭剂：0.5%-1%的牛血清白蛋白（BSA）10%的小牛血清1%明胶10包被：用0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原(OVA，10g/ml)稀释。100 l/well加入聚苯乙烯酶标板中，4 over night。次日，弃去孔内溶液。封闭：加入150 l/well 1%PBS-脱脂奶粉，37 for 40mins。加一抗：弃去封闭液，加倍比稀释的抗体100 l/孔（

5、稀释与加板方法见后) 37孵育40mins ；孵育结束后，用PBS-T洗三次。 酶抗：酶标抗体 (HRP-羊抗鼠IgG)，100l/well ，置37孵育40mins，用PBS-T洗三次。显色：于各反应孔中加入新鲜配制的底物溶液100l/well。 终止：加50 l/well2M硫酸(终止液)。(altering the pH) 判定： 肉眼观察：与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔，相对应的抗体稀释度为该抗体的效价。酶标仪测量： 490nm滤光片下测光吸收值(A)，与阴性对照A值相比其比值2，相对应的抗体稀释度为该抗体的效价。 实验步骤11抗体的稀释方法1.准备7个稀释管，做好标记。2.

6、每管加入PBS 500ul。3.取出抗体原液500ul加入第一管，混匀后，取出500ul加入第二管，依此类推至第七管。12加样方法12空白空白依此类推10:空白对照1:阴性对照抗原（OVA）一抗（血清）酶标二抗-+-阴性空白空白+2:阴性对照+-+阴性13洗 液（PBS-T）磷酸盐缓冲液：（PBS）吐温20（Tween 20):非离子型表面活性剂抑制蛋白质非特异性吸附于塑料表面14标记抗体常用的酶辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。葡萄糖氧化酶、-D-半乳糖苷酶和脲酶等。 15显色原理常用的供氢体： 邻苯二胺 OPD 四甲基联苯胺 TMB ABTS DH2 + H2O2HRPD + 2H2O16注意事项加样时应将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，避免出现气泡。加样器头不能混