16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程

1、16SrDNAM定菌株的标准操作规程2020年4月19日文档仅供参考，不当之处，请联系改正16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程.适用范围本标准规定了经过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信 息的操作规程。本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化 鉴定提供指导信息。.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌 16SrDNA序列测序的方法对细 菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCRT增、扩增产物纯化、 DNA测序、序列比对等步骤。是一种快 速获得细菌种属信息的方法。细菌rRNA （核糖体R

2、NA按沉降系数分为3种，分别为5S、 16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码 16S rRNA相对 应的DNA序歹Jo 16S rDNA由于大小适中， 约1.5Kb左右，既能体 现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序 列，故被细菌学家和分类学家接受。在 16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，因此可利用恒定区序列设计引物，将 16S rDNA 片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细2020年4月19日文档仅供参考，不当之处，请联系改正菌进行分类鉴定。16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的

3、细菌 种属的特异性信息，因此对于绝大多数菌株来说，只需要第一对 引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表 或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的 16SrDNA的序列信息。由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，一般将 16SrDNAr长序列分成3部分进行测序。16SrD .27 519357 TOC o 1-5 h z 111926，1493对引物正反向测通后，拼接成 1500bp左右的16SrDNA手 歹限3,设备和材料2020年4月19日文档仅供参考，不当之处，请联系改正3.1 器材移液器

4、（ 1000w L、200 pL、100p L、10 w L）;涡旋振荡器；Eppendorf MixMate ;离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler ; 凝胶成像仪:VersaDoc MP 4000;基因分析仪： AB350Q AB3130试齐ijDNA快速提取试剂：PrepMan Ultra ;琼脂糖；PCR试剂：Taq2+酶，10 x Taq Buffer(Mg ), dNTPs ddHO 等；ExoSAP-IT ;测序 试齐ij : BigDye Terminator , 5X Sequencing Buffer

5、 ; BigDye XTerminator Purification Kit ;耗材移液器吸头：1000口、200 口、10pL ;离心管：1.5mL、 200 p L; Micro AmpTM Optical 96-Well Reaction Plate ; Micro AmpMOptical Adhesive Film;3.4 引物16SrDNA正向引物27F5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3第1部分反向引物519R5- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3500 bp左右正向引物357F5- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3

6、第2部分反向引物1115R5-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3750bp左右第3部分正向引物926F5- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3560 bp左右2020年4月19日4文档仅供参考，不当之处，请联系改正。反向引物 1492R 5-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3-其中 M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1.操作流程核酸产物测序I序列.实验方法核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有 100 H LPrepMan Ultra的离心管 中，涡旋震荡混匀 30s左右，

7、然后100 c水浴10min后，以离心 机最大转速离心 3min,取10 HL上清液与490 L ddH?O（即稀释 50倍），混匀作为下步 PCR勺模板DNA提取的DNAT-20 C保 存。基因扩增PCR5应体系试齐使用量（25. L体系）模板DNA21a (10ng100ng)Taq 酶(5U30.2 p L10Taq Buffer(Mg2+)2.5 i LdNTPs(各 2.5mM)2 n L2020年4月19日5文档仅供参考，不当之处，请联系改正引物F(1 pM)5 n L引物R(1 pM)5 n LddH2O8.3 p L备注：DNMI板量一般在100 ng以下，必要时可进行梯度稀 释，确定最佳的DNA莫板使用量。PC皈应体系应在冰中配置， 然后置于冰箱中冷却 35min,最后放于PCF58 C： 30s30C72 C： 45s72 C： 5min4 C ： oo5.2.3 电泳称取1g琼脂糖置于1