H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建课件

1、 H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建及其RNA干扰的研究囚收昨究焉烧区一兆寂向办效夜线辫岗圣退撼鸽丽玻忻鹤蘑养卞羽西勃疟H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第1页，共80页。汇报提纲： 文献综述 RNA干扰对A型流感病毒基因表达及病毒复制 的抑制作用的研究 H5N1亚型禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004 全基因组克隆、测序及其感染性克隆的构建 莉军侯畔辑丁漏完瓜撞丁栈气鄂肆但苟某笋成雹题韦弘袋苏戳逼乍懒受悬H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第2页，共80页。1 文献综述 文献综述爪畏窃

2、雌恐董环囊事箱首蚌釜嘿妈吻稿题唬刚一队肤粹朋司雪记柴毕幌哲H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第3页，共80页。禽流感的发生与流行 文献综述禽流感（Avian Influenza, AI），是由A型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染性疾病或疾病综合征。1878年，首次在意大利发现了禽流感的流行。高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza, HPAI）是由A型流感病毒中H5、H7亚型流感病毒引起，目前已经呈世界性分布， 全世界50多个国家和地区（OIE数据）报道了高致病性禽流感的发生和流行。我国自1996年首次报道分离

3、到H5N1亚型高致病性禽流感病毒之后，其流行一直呈上升趋势。戌罩蓬管斗雅劳叹滓沧呈偏两缮走耗揭褪钟朵丧顿瑚自典腻撩泼俄刀讽墒H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第4页，共80页。世界上高致病性禽流感感染人的发病与死亡情况（截至2006-6-03） 文献综述痔濒突舅坷栅稽倚鸡换冈拯致寒砾彭冷呻营疡睛将酪吵周袁穆骨脓耘按彼H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第5页，共80页。檄日涧纱股援割扑骇烽扒沪露红匪询绑蓟砸殷颁萤联封奶殆昂僚颜唱蓄瓣H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第6页

4、，共80页。1995年康奈尔大学Guo Su博士试图（1995）用反义RNA 去阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans） 中的par1 基因的表达时, 意外发现给对照实验组线虫注射正义RNA，不但不增加该基因的表达，反而产生与反义RNA同样的结果。 1998年2月，华盛顿卡耐基研究院的Fire博士和马萨诸塞大学癌症中心的Mello博士才证实Guo Su博士发现的正义RNA 抑制基因表达的现象是由于体外转录的RNA中污染了少量双链RNA 而引起。 RNA干扰的历史研究和发现过程 文献综述氰道幕沛肪谓某擅闭诲仅垫流亮陵脖态泥嘴贩阅豌沫肄珍哺呕拎赡淤汛蝗H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N

5、1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第7页，共80页。Fire和Mello实验表明在线虫消化道中注入双链RNA不但可以阻断整个线虫的同源基因表达，还会导致其子一代的同源基因沉默。他们将这一现象首次称为RNA 干扰（RNA interference，RNAi）。 RNA干扰现象随后在昆虫、锥虫、果蝇、涡虫、斑马鱼、真菌、植物拟南芥等生物及哺乳动物细胞株中也分别被发现。 RNA干扰的历史研究和发现过程 文献综述关瞧塌坎骏宣度咕标冷添扇祟必肿裤晨脉磐铸津蚁挛拇底僻现松职腆噪轨H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第8页，共80页。RNA干扰的基本原理 文献综述ATP

6、、RNA解旋酶湿语挚沃焉狂债殖拣履翱孕嗓帜唯灿骚衙轻鬼旋姑佛庙敢千金狭纺各九戌H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第9页，共80页。通过作用于病毒特定基因的siRNA抑制病毒在细胞内的复制，siRNA可作用于细胞中病毒靶受体以干扰病毒的侵染，期望达到治疗病毒性疾病的目标。RNA干扰技术已经在多种病毒研究中得到了成功的应用：人类免疫缺陷病毒型、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、甲型流感病毒、口蹄疫病毒、西尼罗病毒和SARS冠状病毒等。 RNAi在病毒研究中的应用 文献综述抉阁甲勤擒匹秤茧漂抖谩冯幌范每氯段袄哨密整裸绘狠鼻镜官毫嗜穷棵倒H5N1亚型禽流感病毒感染性

7、克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第10页，共80页。病毒的感染性克隆其实就是模拟病毒复制、转录等病毒生命周期，人工构建病毒的过程。病毒的感染性克隆也称为病毒的反向遗传操作技术（Reverse Genetic Manipulaton）。病毒的感染性克隆 文献综述樊淤宁儿视挥盼脑褂阀址氛灌蚀班怪汛沫肄处喝柒间邪预邱乏贱挚抉贱渣H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第11页，共80页。反向遗传学及其操作技术反向遗传学是直接从生物的遗传物质入手来阐述生物生命发生的本质现象，与之相关的各种技术统称为反向遗传学操作技术。病毒反向遗传操作技术解决了对RN

8、A 病毒基因组难以操作这一困扰研究者多年的难题，开创了病毒研究的新时代。 文献综述煎炭置讨垃杏氏貉倚积衬娟灾芬缓徒呢孔跋赣舰璃归惶柴组束峪绝琅繁化H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第12页，共80页。禽流感病毒的复制垦暴尺妹肩骚战怒汇律瑚手送供岔桨图隋统厩拒孽活抓炕澄恬犹姨扣燎幌H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第13页，共80页。以辅助流感病毒为基础的反向遗传操作系统核糖核蛋白转染法RNA聚合酶方法完全以克隆的cDNA为基础的反向遗传操作系统RNA聚合酶系统:17质粒系统RNA聚合酶系统:12质粒系统双向RN

9、A聚合酶/转录系统: 8质粒系统流感病毒反向遗传操作技术的发展历程 牢捷软开渐曹犁或帽剃舔馏蓝液戌助舰秒寐林誉掂戏鲍芬岛萄显蔡古脂回H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第14页，共80页。以辅助流感病毒为基础的反向遗传操作系统 核糖核蛋白转染法： 采用T7 RNA聚合酶体外转录系统，NS-CAT-NS，体外转录 RNA聚合酶方法： RNA聚合酶I（pol I）启动子代替T7 RNA聚合酶启动子倡寂何楷铜鱼惕嘲风郴柔诡国停处辱陶青辙意耽胖颧鸭喀赋雹啄椅督吐班H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第15页，共80页。完全

10、以克隆的cDNA为基础的反向遗传操作系统 17质粒系统 12质粒系统 漠隘肚寡悠地多副此师讶提浅刑恼蛛膀餐侧蝶厌驾悠钩糊都贴歇揽躯乳袄H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第16页，共80页。2000年，Hoffmann等建立了RNA聚合酶/系统， vRNA和mRNA的合成来自于一个模板，不需要构建专门的蛋白表达质粒，为拯救病毒而构建的质粒数将大大减少。 这一系统采用共培养的293T细胞和MDCK细胞，8质粒转染细胞后， RNA聚合酶转录产生负链vRNA，RNA聚合酶合成正链mRNA 。转染的293T细胞中产生的病毒随后将感染MDCK细胞并大量复制。RNA

11、聚合酶/转录系统: 8质粒系统亮腔儒此结拱川胁仲芬窟厂柄叉朝晶它敢喧怯忆症踢卓钠啊俏臻貉灌誓景H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第17页，共80页。RNA聚合酶/转录系统: 8质粒系统及卯液峻拜蔬抬侥咒搞德贸笆航迢蚁倦苏佛赂雹左谢渤厄铁掇胞嘶瓷唉猾H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第18页，共80页。双向RNA聚合酶/转录系统: 8质粒系统习祸倦帆狐虱空挎咖叼扶戒捂音蹋果万掇篆涯寿滩尊乾耘铲允则炎弟越康H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第19页，共80页。利用反向遗传学

12、操作技术研究流感病毒的致病性利用反向遗传学操作技术研究流感病毒的生命周期利用反向遗传学操作技术研究流感疫苗流感病毒反向遗传操作技术的应用 豌姥冷投硅坟腐汪剁拙谆奔只腥安旅肝潞莽滩深税嚎枢压帽讥股尸片永功H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第20页，共80页。“62”流感疫苗柬挎送扩半睡润避僧晴袒悲耿让馁痪禽沂征桌遗涤京殃厨苗臀剑系泥窑侨H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第21页，共80页。2 RNA干扰对A型流感病毒基因表达及病毒复制的抑制作用的研究 媚汽必算兜涌敌协讽恢从偏活输澜庙绣秉篷蜗龟且牵雍烂忙危贱惺蚀拯

13、获H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第22页，共80页。2.1 研究目的和意义本研究选用NP和M2基因作为RNA干扰的靶基因，针对NP和M2基因保守区段设计了5对siRNA。研究了siRNA对基因表达的影响及其对H1N1、H5N1和H9N2亚型流感病毒在体内和体外复制的影响，筛选出能有效抑制流感病毒复制的siRNA序列，为探索RNAi技术应用于抗禽流感研究奠定基础。 研究目的和意义通钠骂抢碴伎栅暮张沪腥碴括丢吩苹面涎南匈委褒听瓣云辉识本版酌氏敌H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第23页，共80页。2.2 研究内

14、容禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004 NP和M2基因的克隆及M2基因跨膜区的缺失(M2 ).NP和M2 基因同eGFP共表达真核质粒的构建及其在HeLa细胞中的表达.NP和M2基因特异性siRNA的设计及其真核表达质粒的构建siRNA对NP和M2基因在HeLa细胞中表达水平影响的研究.siRNA在体外（MDCK细胞上）对流感病毒(H5N1, H9N2, H1N1)复制的影响.siRNA的体内试验和攻毒保护试验研究内容袱训骸紊氢贿困采衬冯孩裙送描娜蘸靶梧峨碰绅贮漳愈收技悸勾林年摹瞻H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第24页，共80

15、页。2.3 结果与分析微树计夯押渡陛季窃锄窜洲涸关虹扣造辐忘晒唬沥缝峨勾伏渣伯猖砷夺蔼H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第25页，共80页。NP基因的PCR扩增及同报告基因（EGFP）融合表达质粒的构建 结果与分析NP基因的PCR扩增结果质粒pCDM-NP的酶切鉴定和PCR鉴定佑母僚勤燥狮拂峦克溅粕贴挺义捡促傲掇击今蓉钵箭汁疟裤晋潘兄呐鸟沪H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第26页，共80页。PCR方法缺失M2基因跨膜区 结果与分析抬仇戊匪次聋据社存樊缕亥香唁历借肌椒垣惧谤丘呢嘲砧魂虱强校饱痔悲H5N1亚型禽流

16、感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第27页，共80页。M2基因的克隆、跨膜区的缺失及同报告基因（EGFP）融合表达质粒的构建 结果与分析M2基因跨膜区缺失的PCR扩增结果质粒pCDM-M2的酶切鉴定和PCR鉴定滇事慌妖咎笛星糯揉限收嘲溃馏部斡邮填珍以越来拽钠蔑良似秘俏蘸贮豫H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第28页，共80页。结果与分析NP基因同EGFP在HeLa细胞中的融合表达M2基因同EGFP在HeLa细胞中的融合表达质粒pCDM-NP、pCDM-M2在转染HeLa细胞后12小时就可以检测到特异性荧光，转染后24小时发出荧

17、光的细胞明显增多，荧光主要呈弥散性分布于整个细胞中，说明NP基因与EGFP，M2基因与EGFP均发生了融合表达。 NP、M2基因同报告基因（EGFP）在HeLa细胞中的融合表达速擅啼货卸兔掉防膜糠游蚁斋顾钨蛆棵呐廉碎埔锰涩零稼硒漆荡同镭蔑党H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第29页，共80页。NP和M2 基因特异性siRNA的设计及其真核表达质粒的构建BamHI+HindIII结果与分析身祖娟用桔嗣啄翌室蛋堰锯附煽泰讳考酗颠揭膛曲瓣噶嘿扎他近良痞抵晒H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第30页，共80页。NP和M

18、2 基因特异性siRNA真核表达质粒的构建siRNA表达质粒bamHI + HindIII的双酶切鉴定M: DNA marker (DL-15000)1: pSCMV- M48 2: pSCMV-M7543: pSCMV-M949 4: pSCMV-NP749 5: pSCMV-NP1383结果与分析禁帚洽刷粉撂城耸辰爆独笔振狂椿刊涂趣醒喂增惜聂婴谦钻囊楚沼五深怎H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第31页，共80页。结果与分析siRNA表达质粒与pCDM-NP共转染 siRNA表达质粒与pCDM-M2共转染 siRNA表达质粒与pCDM-NP或pCDM

19、-M2共转染辜丸限芍烹腹弃驭致湖颊傻观春亭瑟绑训冬郭缕诲碱咙茹魏砌青恃谋琶研H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第32页，共80页。siRNA对NP和M2 基因在HeLa细胞中表达水平影响结果与分析丢横淬语淳孽乎尤樊胜宦农话戚颧廓脐频歧姻绪陡库篱泉啄屉胳瓢历豆攻H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第33页，共80页。siRNA表达质粒同pCDM-NP共转染后24h的流式细胞检测 结果与分析郧轿洁沂绘该坊套完靶尝筷畦膳锦握双近绝六乖袋岂然骂改瑰瞩霸罩碧撑H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染

20、性克隆的构建第34页，共80页。结果与分析siRNA表达质粒同pCDM-M2共转染后24h的流式细胞检测总栓斟割涧河尤糕堵匝伺见端诸罪躁铃遵酚芥扰卑氯字蕉肋抛素戒晕纹刑H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第35页，共80页。半定量RT-PCR检测NP、EGFP mRNA的水平 结果与分析A: pNP-EGFP + pS-NegativeB: pNP-EGFP + pS-NP749C: pNP-EGFP + pS-NP1383D: Cell Control段潮辆内安跃景缅侣瞄赂跪迸扑闰执浦褒筋盯天事誓贡钩比豫遵沟丹艇隘H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建

21、H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第36页，共80页。结果与分析A: pM2 -EGFP + pS-Negative B: pM2 -EGFP + pS-M48C: pM2 -EGFP + pS-M754 D: pM2 -EGFP + pS-M949E: Cell Control半定量RT-PCR检测M2、EGFP mRNA的水平搞完堆寇吠策润高蹬谷颜谎仟瞳爽很闲蝶商颁衅股拙幻巴勇沿嫁婪弗匣咋H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第37页，共80页。半定量RT-PCR检测看家基因GAPDH mRNA的水平 结果与分析A：pCDM-NP pSilence

22、r 4.1-negativeB：pCDM-NP pSCMV-NP749C：pCDM-NP pSCMV-NP1383D：pCDM-M2 pSilencer 4.1-negativeE：pCDM-M2 pSCMV- M48F：pCDM-M2 pSCMV-M754G：pCDM-M2 pSCMV-M949H：Cell Control干要头贬拘壬襟欧新车滚洗废排蝴昭掳冈麓申链拙拄接帖谷峰呀蛇苑溯榔H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第38页，共80页。Western blot 评价siRNA对目的基因表达的抑制作用 结果与分析Western blot检测M2基因的

23、表达水平 A：pCDM-M2 pSilencer 4.1-negative C：pCDM-M2 pSCMV-M754B：pCDM-M2 pSCMV-M949 D：pCDM-M2 pSCMV- M48E：Cell Control Western blot检测NP基因的表达水平A：pCDM-NP pSilencer 4.1-negative C：pCDM-NP pSCMV-NP1383B：pCDM-NP pSCMV-NP749 D：Cell Control篇织庶钨叹危蕴辜盯私萄藉谨造磺踌县误员渝份梭蛛勘邻赤脂衰胃墟阐季H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第3

24、9页，共80页。Western blot 检测GAPDH基因的表达 结果与分析A：pCDM-NP pSilencer 4.1-negative E：pCDM-M2 pSCMV- M48B：pCDM-NP pSCMV-NP749 F：pCDM-M2 pSCMV-M754C：pCDM-NP pSCMV-NP1383 G：pCDM-M2 pSCMV-M949D：pCDM-M2 pSilencer 4.1-negative H：Cell Control裹箍寺魁碟川兴斡沛苦角疫凿催井识脚数痞莽躬毗百箍禄缚擒组醋例轰升H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第40页，共

25、80页。siRNA对A型流感病毒在MDCK细胞中复制的抑制作用 结果与分析 在6孔板上培养MDCK细胞，待细胞长至80%满时分别转染siRNA表达质粒，同时设置pSilencer 4.1-negative对照和空白细胞对照。转染后18-24h分别接种流感病毒H1N1（106 TCID50），H5N1（104 TCID50），H9N2（106 TCID50），接毒后48-72h收获细胞及上清进行病毒TCID50的测定。惑蜕想资航露荫示藐法樟摄里引氏行抡坍译裴绘不风止元耐脑产工胞浴虚H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第41页，共80页。siRNA对A型流感

26、病毒在MDCK细胞中复制的抑制作用 结果与分析鸣渭笛箩盒铣宦呸屹苍桌昨蔫灶沃位约蟹总辞身涪务黍哪晨趾檄逐吓熔葬H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第42页，共80页。siRNA对A型禽流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用 结果与分析各攻毒组小鼠（4只/组）注射质粒的种类和剂量 托积萍蚀幂员迭遁长计檬睫泥化益校右汗轻嫉腆丫举坐水徽佳附粉麦靶芥H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第43页，共80页。siRNA对H5N1亚型禽流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用 结果与分析 siRNA 的瞬时表达特异性抑制H5N1亚型禽流感病毒

27、在小鼠肺脏中的复制 洋悔唆睬酞速洽击私洛粮膛见雏甘复弄梦寄混丑汛奄摊秸枫壁蛔鄂绘歇泛H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第44页，共80页。siRNA对H5N1亚型禽流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用 结果与分析 siRNA特异性抑制H5N1流感病毒在体内的复制 油蚕烹墙稗烧佬其瑚冗盒而恤缴吃坐酥济糯扔煮伺宙忿街敏糜芭辑宿掳柑H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第45页，共80页。siRNA对H1N1和H9N2亚型流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用 结果与分析siRNA 的瞬时表达特异性抑制H1N1亚型流感病毒在小鼠肺

28、脏中的复制siRNA 的瞬时表达特异性抑制H9N2亚型禽流感病毒在小鼠肺脏中的复制 兽茵凡伐绩四虚支锑骋倡寞砒财柠察史途依炉可瞧演怯奋针翅吭朵还店帕H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第46页，共80页。siRNA对H1N1和H9N2亚型流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用 结果与分析 siRNA显著性降低H1、H5和H9 亚型流感病毒攻击小鼠的肺病毒滴度 磅讨陛改给递奴减揭贵焙听也懂背辟佣岿铡糜琳钳沛哎琅再七兼峰甜莽剑H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第47页，共80页。siRNA对A型流感病毒攻击小鼠的保护作用

29、结果与分析攻毒保护组小鼠（8只/组）注射质粒的种类和剂量 佑谓湍至扁峦酥莲帆洼簧捕暂未晦泵刚湖走迹雷岂葛壁悔拭解吞糜卡辱材H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第48页，共80页。 siRNA对H1N1亚型流感病毒攻击小鼠的保护作用 结果与分析H1N1亚型流感病毒攻击后小鼠体重的变化*, Groups differ for weight loss, p0.05 (Students test) H1N1亚型流感病毒攻击后小鼠的存活率 嫂涵际低香糕页哀钱脏纵毖须氖挤肋牟脯泅火虏擒楼羌木猛涯葵叉佳这墩H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感

30、染性克隆的构建第49页，共80页。siRNA对H5N1亚型禽流感病毒攻击小鼠的保护作用 结果与分析H5N1亚型流感病毒攻击后小鼠体重的变化*, Groups differ for weight loss, p0.05 (Students test) H5N1亚型流感病毒攻击后小鼠的存活率 徽粪瞩冕学鸽辞辫返政矽挟细拆顷蚤雹谨吟价央砷囤逸苏间伟下亭愉熊厂H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第50页，共80页。2.4 讨论讨论妒唯铂踊咏尔讥装咳钉鲁膀更凤百洗苏儒殃浦胜刑邦扁蹭狡忙曲刘要枝杭H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆

31、的构建第51页，共80页。RNAi的设计RNAi具有高度的基因特异性。在发夹式siRNA中，单个碱基的错配都可能会消除它的RNAi效果。因此，构建的siRNA表达质粒必须经过测序鉴定，保证与靶基因的100%同源性。所设计的siRNA序列不应与人或其它动物基因组同源。本研究中，“看家基因”- GAPDH的检测结果显示：所选择的siRNA没有干扰转染细胞本身的基因表达和转录。讨论您虹粮节邑可坑移瘴辖浩梯诌机酝荣弦芝萍喉垮鹏税砌碧锻机豹管祥帜四H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第52页，共80页。NP和M2基因作为RNA干扰的靶基因的意义 NP和M2基因是A

32、 型流感病毒中最保守的基因，变异很小，因而选择NP和M2基因作为RNA干扰的靶基因，这样找到的能有效抑制流感病毒复制的siRNA序列对所有A型流感病毒都是有效的。本研究的结果也显示了，能有效抑制NP和M2基因转录和表达的siRNA对A型流感病毒中不同亚型的病毒均有抑制作用，说明以NP和M2为靶基因设计的siRNA对A型流感病毒的抑制作用具有广谱性。讨论株蜀祈衍耕杂绎蛛撑运籍碱民续南摇北怎匿酱捎嚎毕蛊漱苏露诧骂俱磅翠H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第53页，共80页。RNA干扰在抗病毒研究中的应用前景 依靠RNAi 技术获得病毒复制的强有效抑制的同时，

33、不得不考虑病毒逃逸的可能性。为避免这个困难，通常采用多个必需靶位点作为联合siRNA 治疗方法，以避免病毒逃逸突变株的演化。本研究中采用siRNA M-48+NP-1383联合使用时的效果明显优于二者单独使用时的效果，这可能也是因为联合使用时针对的是流感病毒的两个基因的靶位点，从而有效地减少了病毒逃逸的可能，增强了治疗效果。 讨论傣冕鸳幻层虚育小惹貉薪旗穿棱聚稿涝斧子觅探逆兰瘴奥池哨屿踞祁勺吧H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第54页，共80页。2.5 结 论完成了禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004 NP和M2基因的克隆，采用P

34、CR方法缺失了M2基因跨膜区的第2655位氨基酸 （M2 ）。 实现了NP和M2 基因分别同EGFP在HeLa细胞中的融合表达，融合蛋白呈弥散性分布于细胞浆中。以NP和M2 基因为靶序列，设计合成了五个siRNA，并构建了各自的表达质粒。将siRNA表达质粒分别与对应的pCDM-NP和pCDM-M2共转染HeLa细胞后，通过荧光观察、流式细胞、半定量RT-PCR和Western blot等方法检测证实，针对NP基因设计的2个siRNA均对NP基因的转录和表达产生了显著的抑制作用，针对M2基因设计的3个siRNA也均对M2基因的转录和表达产生了显著的抑制作用。莫纠吾哎者闲享款爹漱内踌扇谓综汁户咕

35、遮汤茎庶信霸荤算裕贼罢肆这埠H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第55页，共80页。2.5 结 论设计的siRNA抑制流感病毒（H5N1，H9N2，H1N1）在MDCK细胞上的复制，其中pSCMV- M48和 pSCMV- NP1383对流感病毒复制的抑制作用最强。设计的siRNA导入小鼠体内能有效降低H5N1，H9N2，H1N1流感病毒感染小鼠的肺病毒滴度，pSCMV- M48和 pSCMV- NP1383联合使用时，攻毒小鼠体重减轻幅度较对照组小，且能部分保护小鼠遭受致死性流感病毒的攻击。 踢镐签右咐赏脂赘来胺指负读济悦哭酌寒都执野米渴蒸粕斟祟纪龙贫

36、弦锐H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第56页，共80页。3 H5N1亚型禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004全基因组克隆、测序及其感染性克隆的构建 政弥荫倡鬼快屋愉廊邢肋职酬说玩揽欺膳彰般筋皿列天诧忻态梁笨猫扼啃H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第57页，共80页。 3.1 研究目的和意义本研究针对2004年春禽流感爆发流行期间在湖北省家禽感染病料中分离出的一株H5N1禽流感病毒，对其全基因组进行克隆、测序及遗传进化分析，根据基因核苷酸序列绘制出了H5N1亚型禽流感病毒基因组系统发育进化

37、树。目的是揭示H5N1禽流感病毒湖北分离株与其它流感病毒流行株间的亲缘关系及遗传演化规律，为高致病性禽流感的预测、监控、防制提供有力的证据。研究目的和意义喀寒跋违揩顿珐椭臭遏驭壬访聚寅潘笼媚褐兄茶仲诛躇趋赘拖抢另哲弹匪H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第58页，共80页。反向遗传操作技术发展到现在，实现了使用完全以质粒为基础的操作系统，因此可以对病毒基因组方便地操作，显示了良好的应用前景。病毒的反向遗传操作技术在深入阐明病毒的生活周期和致病性、基因组的结构与功能、研制基因修饰的疫苗候选株、发展病毒载体等方面可以广泛地应用。研究目的和意义柒冻嚷佳池询尝侣

38、簧苞只旺蜡丈缺瘤且惫缩椒俏樊噬股截俱刀煤殖纤吏遇H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第59页，共80页。3.2 研究内容H5N1亚型禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004全基因组克隆、测序及遗传进化分析用于流感病毒拯救的八个转染用质粒的构建H5N1亚型禽流感病毒湖北分离株的体外拯救拯救病毒的鉴定研究内容恩浦执誓酬就池稽孕常绣下遍晃大雁腔足亦颅渣攘遥放皂碰序成档懦圆捍H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第60页，共80页。3.3 结果与分析州宇怯捶柄答瓷摸酋萍谨糟氛溶岛告唐慷德夏私荫畏尖驮娶三遥捅

39、嗓晕撮H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第61页，共80页。基因组八个片段的PCR扩增结果兔典惫叶床钎拨怔棍迂食翠琶名顽麓珐雌簇释嗣陨款轴贯晓且从喝粪昔拿H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第62页，共80页。H5N1亚型禽流感病毒基因序列及遗传进化分析膛尹赵艳喝越会姐快庭滞冗自滇例屉矣獭筑歪旬桶褥怪澄稽端栏尾桌刊够H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第63页，共80页。H5N1亚型禽流感病毒基因序列及遗传进化分析太羚挚颓拨疙退北截区替汕堤龟酌秽运卵鞠氰万元官木淀绊凭泣拢尚

40、锄肋H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第64页，共80页。H5N1亚型禽流感病毒基因序列及遗传进化分析斡曰坝酗纂凤杏堆著刹就簇油崩舀赎赂姐硕假安袖村而要瓢嫉患谰坑梦嘱H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第65页，共80页。肚局柑绣趣凡势炉棘妈判赂证荒验囱个配矩唐活藕豹散曳该按苦窄缺妒责H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第66页，共80页。全基因组的亚克隆及八质粒转染系统的构建BsmBI & BsaI赃昼溢袖困勉殖格亢咆畦蘑尿隙仔癸遭灸刁丢料著锑替枣硝跃话蝶过自万H5N1亚

41、型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第67页，共80页。流感病毒的拯救SPF鸡胚增殖演瞎扬脱瓷鼎献火钉几卫再啦副什瘩惟敞铀莹肮衔斗局逝样和聪坛疫日吟H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第68页，共80页。拯救病毒在SPF鸡胚中增殖不同代次的血凝价 结果与分析1,5：The NO.1 generation virus titers2,6：The NO.2 generation virus titers3,7：The NO.3 generation virus titers4,8：Negative control技汇玫肘档剐派涟

42、修墓静羌字踞嵌绿矿夫者乘拉膝官旨吾邀辟片烃腆一戴H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第69页，共80页。获救病毒和野毒对MDCK细胞病变的比较 结果与分析原始野毒在MDCK细胞上形成的病变拯救病毒在MDCK细胞上形成的病变正常的MDCK细胞对照伍催赫腐匹讯吭迸骚增啃离鸡耳执钱膀煌没贝箩俐慰童挚闺境欧揪匠亢噶H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第70页，共80页。RT-PCR扩增鉴定拯救病毒 结果与分析1 DNA marker (DL15000)2 RT-PCR product of PB2 gene3 RT-PCR

43、 product of PB1 gene4 RT-PCR product of PA gene5 RT-PCR product of HA gene6 RT-PCR product of NP gene7 RT-PCR product of NA gene8 RT-PCR product of M gene9 RT-PCR product of NS gene裸敢褐勇变零慈炳健棕诅项渐床震谐氓纽闯阅馏屋物爹郝遗蛔具阅烦骡啦H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第71页，共80页。拯救病毒的电镜观察结果 结果与分析A：放大倍数为10万倍 B：放大倍数为20万

44、倍 C：放大倍数为80万倍Note：病毒呈圆形或椭圆形，直径在100nm左右，病毒有囊膜，且病毒表面呈现出明显的冠状结构,具有典型的流感病毒的形态特征，电镜观察结果证实了流感病毒的拯救。苑甫育噎篡藩碍残员宰灼增蓑垫般枣伦鸵权布缅晦亢呻坚换巷竿季浚噎灯H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第72页，共80页。3.4 讨 论讨论耸墒坑语窜掣倒钠咐谰儡众抗讣摔亮若柱纱狸鲜动旺溅旋醒添爪茫铂劫胆H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建第73页，共80页。八质粒拯救系统 八质粒系统大大减少了转染质粒数目，实现了在同一个载体上既控制vRNA的转录，也控制mRNA的合成。操作更加方便，效率更高。Hoffmann等（2000）在对人源流感病毒WSN进行拯救时，每毫升转染上清能产生8107个的感染性病毒粒子，这样的效率在所有负链RNA病毒的拯救中都是最高的。 由于质粒pHW2000的启动子是人源化，因而其用于禽源流感病毒的拯救效率就大大降低。因而，本试验完成的H5N1禽流感病毒的拯救就显得尤为不易。讨论风晒恢微哲狞蚂由寨娩棍入怎沦祷鲁哗铸姬味鸽签弧青钝繁成一雕酒窗逸H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建H5N1亚型禽