(优选)辅助生殖与技术课件

1、辅助生殖与技术第1页，共81页。内容概要植入前遗传学诊断与筛查的概念PGD检测流程染色体易位携带者的PGD基于全染色体筛查的PGD(PGD-CCS)单基因病PGD背景介绍适应征及技术进展临床应用植入前诊断 植入前遗传学诊断和筛查的概念植入前遗传学诊断的临床应用植入前遗传学筛查的临床应用第2页，共81页。一、植入前遗传学诊断与筛查的概念PGD (Preimplantation Genetic Diagnosis)：又称为孕前诊断(preconception genetic diagnosis, PGD)。指在胚胎植入前，利用DNA分析技术对显微活检的胚胎细胞进行染色体异常或遗传性疾病进行诊断，选

2、择正常的胚胎植入。第一部分 植入前遗传学诊断和筛查的概念第3页，共81页。第三代试管婴儿？PGD/PGS是以ICSI-ET为基础，结合显微操作技术和分子生物学研究的而发展起来的。第4页，共81页。PGD的意义PGD可在孕前阶段杜绝X-连锁隐性遗传病、染色体病和基因病患儿的妊娠，避免人工流产终止异常妊娠给广大妇女的身心痛苦。理论上还可减少遗传病在人群中的遗传负荷。PGD是遗传性病防治的重要手段，是Edwards获诺贝尔奖的理由之一。植入前诊断传统的产前诊断第5页，共81页。PGD发展历程最早于1965由Edwards提出。1968年Gardncr和Edwards在显微操纵下对兔囊胚进行活检，取出

3、少量滋养外胚层细胞分析染色质来选择雌性胚胎。1990年Handyside报道了世界第一例植入前性别诊断婴儿的出生，开创了产前诊断的新纪元。1994年，Munne用FISH技术，在植入前诊断胚胎染色体非整倍体及性别获得成功。1999年，Terlin等用巢式PCR和单链多态性分析技术，对单细胞进行视网膜母细胞瘤的易感性分析，在植入前确定胚胎未来发生肿瘤的可能性大小，从而为PGD应用于人类胚胎基因表达的研究开辟了崭新的途径。2001年Verlinsky有报道对胚胎进行HLA选型以便于骨髓移植。进一步拓宽了该技术的研究和应用。第6页，共81页。染色体异常（罗氏易位、相互易位、倒位等） 染色体异常的筛查

4、单基因病（一般的单基因病、性连锁遗传病等）单基因异常的筛查 PGD期望解决的问题第7页，共81页。 植入前遗传学筛查的概念胚胎植入前遗传学筛查（Preimplantation Genetic Screening, PGS），是指胚胎植入着床之前，对早期胚胎进行染色体数目和结构异常的检测，通过一次性检测胚胎23对染色体的结构和数目，挑选正常的胚胎植入子宫，以期获得正常的妊娠，提高患者的临床妊娠率，降低多胎妊娠。PGS目前特指针对染色体数目异常，即非整倍体；PGS理论上将来可以应用于单基因病。PGS是低风险人群，夫妻双方的染色体或者基因是正常的。第8页，共81页。二、PGD检测流程卵子精子ICSI

5、活检取样胚胎冷冻遗传学检测选择胚胎胚胎植入遗传咨询知情谈话FISHCHIPPCRMPSIVF临床促排卵第9页，共81页。极体活检活检第一极体和第二极体，检测母源性的染色体结构异常或基因突变，以及减数分裂异常造成的染色体非整倍体。优点：对卵母细胞的发育没有影响。 缺点：只能检测母源性的染色体异常； 不能检测受精后发生的染色体异常； 可检测细胞数少，易发生检测失败。（一）活检技术选择第10页，共81页。卵裂球活检在D3胚胎发育到6-10细胞时活检出1-2个卵裂球，进行遗传学诊断。 优点：最成熟最常用的活检方法。 缺点：活检出卵裂球后降低了胚胎的发育潜能； 细胞数少，容易发生检测失败(细胞固定及 杂

6、交失败，扩增失败，ADO等)。 第11页，共81页。囊胚活检D5-6天胚胎发育到囊胚阶段后，活检囊胚滋养层细胞进行遗传学检测。 优点：对滋养层细胞的活检不影响将要发育成胎 儿的内细胞团的发育； 可检测细胞数较多，检测失败概率降低。 对SNP-array而言，能大大减低费用。 缺点：大部分情况下（除非可以在24小时之内出结果） 需将活检后的囊胚冷冻保存。 第12页，共81页。染色体易位(Translocation):一种染色体结构异常，一条染色体的一段转移到同一条或另一条染色体上，导致易位片段基因的重排 (Thompson&Thompson GENETICS IN MEDICINE 2010)易

7、位是一种常见的染色体结构重排异常，新生儿中发病率0.2%.(Stern et al., 1999)临床上两种类型的易位最常见：罗氏易位和相互易位一、染色体易位携带者的FISH-PGD第二部分 植入前遗传学诊断的临床应用第13页，共81页。4q2520q12相互易位：两条非同源染色体之间进行片段的交换，常常是整个末端的断裂并互换。- Thompson&Thompson GENETICS IN MEDICINE 2010着丝粒着丝粒Derivative chromosome 4Derivative chromosome 20第14页，共81页。罗氏易位：这种类型的易位是在两组端着丝粒染色体 (D组

8、 and G 组, 染色体13-15, 21-22)间进行交换，往往在靠近着丝粒的区域断裂重组，导致易位的两条染色体随体的丢失-Thompson&Thompson GENETICS IN MEDICINE 2010CentromereCentromereChr21Chr14der(14;21)第15页，共81页。易位携带者的健康风险平衡的染色体易位个体往往没有明显的疾病表型，称为“易位携带者”。但却多存在生殖的障碍；易位携带者主要的遗传风险起源于配子减数分裂的过程，携带者可产生高比例的不平衡配子（精子和卵），可以导致流产，出生染色体异常患儿引起出生缺陷（特别是智力障碍），并可导致不孕和不育；第

9、16页，共81页。平衡易位携带者的遗传风险四射体对于相互易位携带者，配子分离模式理论上产生18种配子类型：包括1种正常, 1种平衡易位型 和16 种不平衡分离的配子。第17页，共81页。normalbalanceddisomy 21disomy 21nullisomy 21Nullisomy 14罗氏易位产生6种配子类型，包括1中正常，1中平衡易位型，其余4种不平衡分离配子，这类不平衡配子往往导致流产。罗氏易位的遗传风险第18页，共81页。染色体易位和生殖健康反复流产： 3-4%的反复流产患者存在染色体结构异常 相互易位占 61%罗氏易位占 16% - Clifford et al. 1994

10、; Franssen et al. 2005我院数据：共发现1425 易位携带者，其中相互易位 76.6% (1094/1428)，罗氏易位 23.4% (334/1428).反复流产 75.2% (1071/1425)严重男性因素 17.2% (245/1425)卵巢功能下降1.2% (18/1425) 第19页，共81页。PGD用于易位携带者治疗的历史产前诊断移植以来被有效的用来避免染色体异常患儿出现，但是诊断异常后流产给妇女带来心理和生理的负担，并可能导致生育障碍；第一例PGD的成功妊娠，利用Y染色体特异性DNA扩增技术成功对人胚胎性别进行诊断并获得妊娠。- Handyside, AH.

11、 Nature,19901998年，FISH技术被用于易位携带者的PGD诊断并获得成功 - Conn CM et al. 1998; Munn S et al.1998;Pierce KE et al. 1998 第20页，共81页。荧光原位杂交(FISH)荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization, FISH）是以利用荧光标记的特定基因或染色体片段作为探针，与染色体特定序列DNA分子杂交，可以确定分裂细胞或间期细胞对应染色体序列的位置及数目，以此检测染色体数目或结构异常。FISH技术有以下几个特点： 安全、快速、灵敏度高； 探针能较长时间保存； 多

12、色标记，简单直观； 可用于中期染色体及间期细胞的分析人类干细胞国家工程研究中心 * 中信湘雅生殖与遗传专科医院第21页，共81页。荧光原位杂交(FISH-PGD)技术流程第22页，共81页。欧洲生殖与胚胎学协会(ESHRE) -FISH-PGD实践指南第23页，共81页。ESHRE要求： 实验室胚胎活检技术； 遗传室细胞核玻片固定基础，并对固定程序有详细要求； 选择合适的探针，对平衡易位患者需提前做好外周血淋巴细胞中期分裂相预实验；欧洲生殖与胚胎学协会(ESHRE) -FISH-PGD实践指南第24页，共81页。细胞核玻片固定程序：活检卵裂球(1枚或2枚)或囊胚滋养层细胞(TE)；低渗液滴中处

13、理5min；在圆圈标记对应的玻片正面部位加固定剂(Tween-20/HC1)，将低渗好的细胞转至固定剂液滴中；待固定剂完全干燥后，可放在-20备用，或者直接进入下一步；60烤片，30min-3h；RNase消化，蜡膜封片，湿盒中37度孵育30min-1h；将RNase处理后的玻片依次过2xSSC、75%、90%、100%酒精，梯度脱水；将玻片放入变性液中，75预变性3-5min（目的是将DNA双链打开）；玻片依次过75%、90%、100%酒精梯度脱水，2min/浓度，完全风干；探针75变性5min；将探针加到风干的玻片样本上，双层蜡膜封片，置于湿盒中，37过夜（杂交4-6h）；玻片依次过洗涤液

14、WS1三缸(45)，WS2两缸（室温），WS3一缸（室温）；75%、90%、100%酒精梯度脱水，风干；加入DAPI，处理3min后，直接荧光显微镜下观察。欧洲生殖与胚胎学协会(ESHRE) -FISH-PGD实践指南第25页，共81页。平衡易位探针选择和淋巴细胞预实验探针的选择：商业探针的使用需通过QC质控；自制探针也需要进行合适的QC/QA鉴定。所有探针在应用到临床检测前都需经过细胞杂交预实验，评估特异性、亮度及弥散度；对于所有平衡易位携带者，需要取用对应易位区段合适的探针以及探针组合对夫妻双方淋巴细胞中期分裂相及间期核进行预实验检测： 至少分析20个中期分裂相，确保探针位置在正确的染色体

15、上，易位片段能被正确指示； 至少分析100个间期核，评估特异性、亮度及弥散度。欧洲生殖与胚胎学协会(ESHRE) -FISH-PGD实践指南着丝粒探针位点特异性探针亚端粒探针第26页，共81页。一例相互易位携带者PGD，核型为： 46,XY,t(6;10)(q13; p15)，活检2枚胚胎，对单卵裂球进行FISH检测，发现1枚信号正常，移植1枚，妊娠单胎，产前诊断为正常核型，已出生正常婴儿。FISH-PGD举例：平衡易位携带者预实验结果：外周血淋巴细胞培养制备的一个中期分裂相和一个间期核FISH探针：易位片段的亚端粒探针（6q136qter，Tel 6q SpectrumOrange；10p1

16、510pter， Tel 10p SpectrumGreen）和10号着丝粒片段的着丝粒探针（10p1510qter,blue CEP10 alpha satellite SpectrumAqua）。第27页，共81页。一例相互易位携带者PGD，核型为： 46,XY,t(6;10)(q13; p15)，活检2枚胚胎，对单卵裂球进行FISH检测，发现1枚信号正常，移植1枚，妊娠单胎，产前诊断为正常核型，已出生正常婴儿。FISH-PGD举例：平衡易位携带者FISH-PGD检测结果：不同通道滤光片下观察到的细胞核中的FISH探针荧光信号。a胚胎细胞核中每个探针均为2个杂交信号提示每个探针位点均为2个

17、拷贝，表示易位相关的染色体组成为正常或平衡易位。b胚胎核中均为1个红色信号、3个绿色信号和2白色信号，分别提示6号易位片段为一个拷贝、10号易位片段为3个拷贝和10号着丝粒片段为2个拷贝，表示该胚胎为临近-1分离形成的6q136qter单体和10p1510pter三体不平衡产物。临近-1分离模式图第28页，共81页。Reciprocal translocation carriersRobertsonian translocation carriersBiopsied cycles257149Oocyte number14.536.5313.816.83Number of good qualit

18、y embryos on D54.61Number of good blastocysts on D50.931.501.041.71Biopsied embryo (median(range)10 (1-30) 9 (1-24)Biopsied embryos27091420 Normal / balanced17.5% (475) 31.8% (451) Unbalanced69.5% (1882) 56.3%(799) Testing failure13.0% (352)12.0% (170)Cancelled cycles (rate)82(31.9%)24(1

19、6.1%)2006-2011 年我院易位携带者进行d3 FISH-PGD结果正常或平衡易位胚胎比例低，尤其是相互易位第29页，共81页。Reciprocal translocation carriersRobertsonian translocation carriersBiopsied cycles257149Oocyte number14.536.5313.816.83Number of good quality embryos on D54.61Number of good blastocysts on D50.931.501.041.71Transferred

20、embryo (median(range)2 (1-3) 2 (1-3)Cycles accepted transfer175125Clinical pregnancy rate per biopsied cycle33.5% (68/257) 32.2% (48/149) Clinical pregnancy rate per ET38.9% (68/175) 38.4% (48/125) Implantation rate32.2% (86/267) 28.1%(62/221)Miscarriage rate16.2% (11/68)16.7% (8/48)Live birth rate

21、per Biopsy22.2% (57/257)26.8% (40/149)Health babies/delivered babies52/5235/352006-2011 年我院易位携带者进行d3 FISH-PGD结果第30页，共81页。单卵裂球FISH几种风险可能导致没有准确结果：杂交背景干扰太强的情况杂交杂质信号干扰的情况杂交失败未见信号的情况固定或重杂交细胞核丢失的情况囊胚FISH相对卵裂期FISH更有优势？1.活检细胞数的增多有利于信号的判定；2.直观方便检出胚胎嵌合体。第31页，共81页。胚胎序号Tel 7p信号数Tel 8q信号数CEP8结果提示1163626异常2173727

22、异常3153525异常4272727正常或平衡易位5143424异常6272727正常或平衡易位7173727异常814342异常9163626异常10243224222422异常11321222异常囊胚FISH-PGD举例：平衡易位第32页，共81页。FISH面临的挑战第33页，共81页。不同实验室FISH检出率和准确率波动较大着床率和妊娠率随着FISH检测错误率的上升而降低第34页，共81页。FISH技术局限FISH技术仅能检测有限的染色体，因此患者经FISH-PGD成功妊娠，但仍不可避免因其它未检测的非整倍体异常妊娠而引发的早期流产或出生缺陷。FISH-PGD早期流产胚胎进行比较基因组杂

23、交检测，检出5号染色体重复。需要全染色体筛查为基础的PGD技术？第35页，共81页。二、基于全染色体筛查的PGD(PGD-CCS)PGD with Comperhansive Chromosome Screening，避免了FISH仅能检测少数染色体的限制，采用全染色体筛查的方式对易位或倒位携带者进行PGD诊断，同时排除其它染色体非整倍体异常。第36页，共81页。易位携带者的SNP-PGD临床情况总结1. 囊胚+SNP活检分析增加PGD诊断的准确性2. 基于SNP的PGD-CCS可以检测出除易位染色体外其他染色体的异常，减少流产第37页，共81页。易位携带者SNP-PGD的临床结局总结第38页

24、，共81页。共分析360 个患者年龄在2044岁之间，平均新发生异常的几率是27.2% Age是否SNP-PGD需要用于每个易位携带者?第39页，共81页。Reciprocal translocation carriersRobertsonian translocation carriersD5-FISHSNP arrayD3-FISHD5-FISHSNP arrayD3-FISHTransfer cycles29771751238125Clinical pregnancy rate per ET55.2%(16/29)63.7%(49/77)38.9% (68/175) 83.3%(10/1

25、2)63.2%(24/38)38.4% (48/125) Implantation rate40%(16/40)59.5%(49/97)32.2% (86/267) 59.1%(10/17)54.9%(28/51)28.1%(62/221)Miscarriage rate25.0%(4/16)8.16%(4/49)16.2% (11/68)0(0/10)12.5%(3/24)16.7% (8/48)Comparison D5-FISH and d5-SNP results in translocation carriers 40种代谢疾病，可覆盖大规模人群建立国家和地区发病率数据库 确认诊断疾

26、病，特别是稀有疾病疾病亚型分类，或鉴别相似表型的不同疾病，进行有效干预 拯救婴儿生命，使他们更健康减少对社会和家庭带来的负担减少出生缺陷指导意义Next Generation Sequencing(NGS)第41页，共81页。NGS-PGD/PGS技术路线WGASNParray检测NGS检测平行实验已知样本非整倍体单个胚胎干细胞正常核型淋巴细胞FISH-PGD诊断为异常的胚胎重活检淋巴细胞全基因组扩增获得产物临床并行实验SNParray检测NGS检测建立平台评估检出率，准确度等指标，芯片与测序相当第42页，共81页。方法学的建立2X 测序深度能覆盖60%人类基因组，10X深度能覆盖90%人类基

27、因组。等位基因脱扣ADO率约5-20%；平均值为4%，近着丝粒区段发生ADO率相对较高。碱基对检出误差：C:GT:A.Before & after GC bias correction专为单细胞测序 CNV 分析而设置的算法，矫正WGA产生的GC偏差，使结果更接近基因组DNA测序水平。 第43页，共81页。NGS vs SNParray 在非整倍体与16M缺失重复的比较方法学的建立第44页，共81页。技术特点高通量，高准确度：使用新一代测序技术，克服PCR技术通量低的缺点。不容易产生漏检：可对所有23对染色体进行检测。FISH技术由于每一轮杂交的探针数目是有限的，无法对所有23对染色体进行检测

28、，容易产生漏检。自动化程度高：测序数据通过SOAP比对，SegSeq软件进行分析第45页，共81页。我们前期已建立了FISH、SNP芯片技术检测染色体异常，并与华大合作建立了单细胞水平的全基因组测序。2012年8月诞生了世界首例由NGS-PGD助孕的健康女婴。我中心完成的NGS-PGD/PGS工作第46页，共81页。三、单基因病PGD第47页，共81页。ESHRE PGD工作组对扩增基础的PGD的最佳实践指南 第48页，共81页。单基因病PGD的流程1. 预备实验 1.1 基因诊断 1.2 设计个性化方案 1.3 构建单体型 1.4 基因组水平实验 1.5 淋巴细胞/废弃胚胎细胞水平实验2.

29、临床实验 2.1 临床前预备实验 2.2 临床诊断3. 产前诊断第49页，共81页。1、等位基因脱扣（allele dropout, ADO） 影响PGD准确性的主要因素之一，其发生率约为5-20%。可导致胚胎的误诊。导致ADO的原因目前仍未充分弄清。解决办法： 采用多重PCR的方法，加入标记位点的检测； 控制扩增片段大小(40%aneuploid cells 25%aneuploid cells 25-40%aneuploid cells FISH reanalysis of inner cell mass and trophectoderm samples of previously ar

30、ray-CGH screened blastocysts shows high accuracy of diagnosis and no major diagnostic impact of mosaicism at the blastocyst stage,Antonio C,et al. Human Reproduction, Vol.0, No.0 pp. 110, 2013真正会影响到移植风险的嵌合胚胎发生率仅为5%.因为绝大多数非整倍体异常在内细胞团与滋养层中共同发生。而在滋养层细胞中可能嵌合存在更多异常。嵌合对PGS诊断的影响第68页，共81页。如何理解卵裂期活检的影响（Timel

31、apse分析）正常卵裂球的移除进一步影响胚胎发育的潜能异常卵裂球的存在影响胚胎的正常诊断第69页，共81页。囊胚活检有替代卵裂期活检的趋势作者认为：卵裂球活检仍相对更加损伤胚胎，临床结局显示囊胚活检应是最为合适的植入前遗传学检测的活检时期。Fertil Steril. 2013 Sep;100(3):608-14. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.07.004.第70页，共81页。极体活检风险最低的活检方法极体活检对胚胎没有损伤，随着极体染色体检测技术的进步，如更精确而且便宜的测序技术的应用，极体活检将成为未来PGD/PGS中一项非常有前景的技术。 第71页，共8

32、1页。讨论：极体活检vs囊胚活检？避免嵌合的影响不影响未来的胚胎仅检测减数分裂错误而未评估有丝分裂错误，而有丝分裂可能修复减数分裂错误 能分析来自父母双方的异常嵌合(滋养外胚层可能不能代表内细胞团) 囊胚培养和玻璃化冷冻美国的Nathan Treff 代表与欧洲的Joep Geraedts达成了许多共识：极体活检与囊胚活检各有优势，不再建议进行卵裂期活检第72页，共81页。Willadsen S et al. Hum. Reprod. 1999;14:470-475早年PGS尝试：利用动物MII卵构建人卵裂球分裂相技术难度大，构建成功率低，无法实现临床应用。全染色体组筛查技术第73页，共81页

33、。全染色体组筛查技术FISH: 9-11条chr所有23对人染色体都需要筛查CGH-比较基因组杂交aCGH: 基因组杂交芯片Microarray SNP RealTime PCRNext Generation Sequencing第74页，共81页。全染色体筛查技术进展1996 Sermon K., et al. Adaptation of the primer extension preamplification (PEP) reaction for preimplantation diagnosis: single blastomere analysis using short PEP p

34、rotocols. Mol Hum Reprod. 1996; 2(3):209-212. (最早用全基因组扩增法进行PGD，但仅筛查几个基因)1999 Wells D., et al. Detailed chromosomal and molecular genetic analysis of single cells by whole genome amplification. Nucleic Acids Res, 27:1214-1218. (首次使用单细胞mCGH做PGS)2005 Knijnenburg J., et al. Rapid detection of genomic im

35、balances using micro-array consisting of pooled BACs covering all human chromosome arms. Nucleic Acids Res. 2005;12(33):e159. (首次用aCGH做PGS)2007 Treff NR., et al. Accurate 23 chromosome aneuploidy screening in human blastomeres using single nucleotide polymorphism (SNP) microarray. Fertil Steril, 200

36、7;86:s217. (首次用SNParray做PGS)2013 Eric J. Forman, et al.Comprehensive chromosome screening alters traditional morphology-based embryo selection:a prospective study of 100 consecutive cycles of planned fresh euploid blastocyst transfer (首次用qPCR做PGS)2013 Chunlei Zhang,et al.A Single Cell Level Based Me

37、thod for Copy Number Variation Analysis by Low Coverage Massively Parallel Sequencing (首次用NGS做PGS)Pubmed总体能够搜索到2881篇文献，自2002年至今，每年平均有176篇，称增长趋势第75页，共81页。作者技术研究对象结论Munn S,2002FISH1235枚淘汰卵裂期胚胎，至少检测3个卵裂球/胚。发现48%复杂嵌合异常，二倍体或多倍体异常占26%。25%的胚胎发生了有丝分裂不分离，16号染色体最常发生异常，但嵌合率的高低与女性年龄无关。Cupisti S, 2003FISH31-34岁女性卵子31-34岁女性卵子的染色单体异常发生率约为11%。Lucille Voullaire,2007CGH28名女性176枚囊胚37岁以下女性非整倍体率18.9%；复杂异常率27.9%；37岁以上女性非整倍体率42.6%；复杂异常率27.8%Liang L,2013CGHarray平均年龄40岁的高龄女性，检测246枚囊胚RCT研究发现高龄女性正常胚胎率能达到36%，有64.7%的病人有可移植胚胎，22个移植周期达到50%的临床妊娠率。证实PGS技术能够显著提高40岁以上女性的移植成功率及抱婴率。Franasiak JM,2014qPCR+SNParray回顾性分析该中心1