临床生物化学检测方法的选择与评价医学教学课件

1、 临床生物化学检测方法的选择与评价第1页，共77页。第2页主要内容第二章 方法评价 临床生化检验方法的选择 1 临床生化检验方法的评价和性能判定2 临床生化检验方法的校准与溯源性 临床生化检验方法的测量不确定度 43第2页，共77页。第一节 临床生物化学检测方法的选择一第3页，共77页。临床生物化学检测方法的分级检测方法决定性方法参考方法常规方法第4页，共77页。第5页决定性方法（definitive method）也称为一级参考方法（primary reference method)参考方法（reference method）也称为二级参考方法（secondary reference met

2、hod）常规方法（routine method）；推荐方法（recommended method） 第5页，共77页。第6页 准确度最高，系统误差最小，经过详细的研究，没有发现产生误差的原因或在某些方面不够明确的方法。决定性方法参考方法 准确度与精密度已经充分证实的分析方法，干扰因素少，系统误差与重复测定的随机误差相比可以忽略不计，有适当的灵敏度、特异性及较宽的分析范围。常规方法 性能指标符合临床或其他目的需要，有足够的精密度、准确度、特异性和适当的分析范围，而且经济实用。 一临床生化检验方法分级第6页，共77页。第7页表2-1 临床生化检验项目的决定性方法、参考方法、常规方法 项目决定性方法

3、 参考方法 常规方法钙ID-MS原子吸收分光光度法邻甲酚酞络合酮法、MTB法氯ID-MS、中子活化法电流滴定法硫氰酸汞法、选择性电极法镁ID-MS原子吸收分光光度法MTB 法钾ID-MS、中子活化法火焰光度法离子选择电极法、火焰光度法钠中子活化法火焰光度法离子选择电极法、火焰光度法清蛋白-免疫化学法溴甲酚绿法总蛋白-凯氏定氮法双缩脲法肌肝ID-MS离子交换层析法苦味酸法、酶法尿素ID-MS尿素酶法二乙酰一肟法、酶法尿酸ID-MS尿酸酶法（紫外）磷钨酸比色法胆红素-重氮反应法J-G 法、钒酸盐氧化法葡萄糖ID-MS已糖激酶法葡萄糖氧化酶法胆固醇ID-MSAbell-Kendall 法酶法甘酒三脂

4、ID-MS变色酸显色法酶法第7页，共77页。第8页 （primary reference materials）也称一级标准品，与决定性方法平行，用于验证决定性方法、评价与校准参考方法，以及为二级标准品定值。 原级参考物质次级参考物质 （secondary reference materials）也称二级标准品 ，二级标准品的定值源于一级标准品和参考方法，主要用于评价常规方法，也可为质控物定值。 常规校准品 校准（calibration）指的是对由仪器、方法和试剂所组成的检测系统的校准过程。电解质、酶类、其他生化指标应合理选择校准品二临床生化检验的参考物质和校准品 第8页，共77页。第9页标准品

5、校准品质控品一级标准品用高纯化学物质（纯度99.98%）直接通过称重配制的溶液，是唯一值。一般由国家标准计量局出具证书。二级标准品某种成分的浓度可用公认的参考方法测定。由参考实验室或权威学术组织出具证书，如SRM、BCR、IFCC。标准品(standard）可用做校准品（calibrater），考虑血清成分复杂、难以避免基质效应 ，建议用与新鲜血清相似的介质做校准品，一般由试剂盒供应商提供和赋值。校准品的量值应有溯源性，不同测定系统赋值不同。质控品多是成分相对稳定的混合血清，分为定值和非定值、冻干或液体，添加了防腐剂和保护剂等。定值往往由试剂盒供应商委托几家实验室在特定测定系统上测得的均值和标

6、准差。第9页，共77页。第10页标准品与校准品大多数定量的方法（分光光度法、电化学、免疫定量）都需要用标准品校准，即通过标准比较来计算。校准是这些方法定量必经的过程。用什么“标准”来校准？罗氏公司的C.f.a.s （calibrator for automation system），属于多项校准品，因使用方便，很多实验室都在使用。但前提是“指定的测定系统”。第10页，共77页。第11页图2-2 方法分级与标准品之间的关系第11页，共77页。临床生物化学常规检测方法的选择临床实验室引入新方法的流程三第12页，共77页。临床生物化学常规检测方法的选择临床需求性能要求 精密度、正确度及准确度、检测限

7、、分析测量范围和分析特异性 携带污染、试剂批间变异、检测器的不精密度确保患者检测结果临床可接受 确定检测需求 探讨检验项目周转时间、临床应用等关键问题 了解临床医生对关键性能指标的要求 了解诊断灵敏度和特异性第13页，共77页。临床生物化学常规检测方法的选择考查候选方法材 料人 员机 器候选方法的选择 测 量环 境方 法第14页，共77页。第15页四检测系统的比对完成一个项目检验所涉及的仪器、试剂、校准品、质控品、操作程序、质量控制、保养计划等的组合称为检测系统（testing system）。常规检测系统有配套检测系统和自建检测系统。（一）检测系统的概念第15页，共77页。第16页 .配套检

8、测系统 自建检测系统 （二）检测系统的分类整个检测系统涉及的各个部分完全按照指定厂商要求配套使用。若该系统已经国家法定部门认证,则使用这样的检测系统对临床样品进行检验，其结果具溯源性。实验室自行建立的检测系统，如A制造商的试剂盒、B制造商的校准品、C制造商分析仪的组合。第16页，共77页。第17页制订分析质量目标 仪器性能评价 确定对比检测系统 内容初步评价检测系统比对允许不精密度、允许偏倚和允许总误差 准确度和精密度 参考系统或公认的测定系统性能指标40-100例（二）检测系统比对的实施步骤可接受性判断步骤第17页，共77页。第18页测定系统方法学操作程序校准品仪器试剂配方和来源测定系统的关

9、键要素第18页，共77页。第19页第19页 1 2统一方法：以方法学评价为基础，提出参考方法或推荐方法。统一试剂的主要成分和测定条件。实施机构：国际临床化学学会、临检中心逐级溯源：常规校准品应向二级标准品、一级标准溯源。实施机构：ISO、国家标准计量局、参考实验室、试剂盒供应商、临床实验室全球性可比性战略实施33保证仪器良好的工作状态、严格的操作规程和质量控制、实验室内部测定系统的比对、实验室间的比对第19页，共77页。第20页方法学的性能指标 一 二 三第二节 临床生化检验方法的性能评价 方法学性能评价的内容 方法学评价试验 临床生物化学方法学性能判断 四第20页，共77页。实用性（微量快速

10、）可行性（条件和费用）可靠性（准确特异安全）基本要求方法选择要求和步骤第21页，共77页。方法学评价是通过实验途径，测定并评价方法的精密度与准确度，强调的都是误差，评价实验的过程就是对误差的测定。 实验方法评价目的和意义第22页，共77页。准确度与偏差系数精密度与变异系数灵敏度与检出限评价指标一、方法评价指标特异度与干扰率线性范围与检测范围实验误差第23页，共77页。1.准确度与偏差系数（CB）测定值与真值的符合程度，常用不准确度表示。偏差系数（CB） =(真值-x真值)100%血糖（5.5 mmol/L）5.4 mmol/L5.0 mmol/L例：第24页，共77页。2.精密度与变异系数（C

11、V）同一标本多次测定值的差异，常用标准差(S)或变异系数表示。N1=5.4 mmol/LN2=5.6 mmol/LN3=5.2 mmol/LN4=5.3 mmol/LN5=5.5 mmol/LN6=5.1 mmol/LN7=5.4 mmol/L血糖（5.5 mmol/L）第25页，共77页。3.灵敏度与检出限：指化学反应中能检出的最小值。常用最小检出量或摩尔消光系数来表示。血清总蛋白（75g/L）双缩脲法（0.2-1.7g/L）溴甲酚绿（0.01g/L）紫外法（0.001g/L）免疫荧光法（0.01mg/L）摩尔消光系数越大,灵敏度越高第26页，共77页。4.特异度与干扰率：指分析测定中只与某

12、一成分发生反应的特性强弱。血清蛋白（g/L）特异性与非特异干扰的区别酶联免疫法（酶与底物,抗原与抗体的特异性结合）双缩脲法（肽键）第27页，共77页。5.线性范围：指实验方法所能检测标本中某物质的浓度范围。A= kC L双缩脲法（0-140 g/L ）溴甲酚绿（10-60g/L）血清蛋白（g/L）第28页，共77页。6.实验误差（error）：测定值与真值的差异。误差系统误差随机误差恒定系统误差比例系统误差偶然误差过失误差第29页，共77页。重复性试验回收试验干扰试验评价实验二、方法评价实验方法比较试验第30页，共77页。第31页回收试验 干扰试验 线性试验 重复性试验对比试验检测限与检测范围

13、批内批间 日内日间总不精密度 方法学评价实验设计准确度第31页，共77页。目的：考察随机误差，评价精密度形式与方法：批内重复实验；天内重复试验；天间重复试验分析样品：采用标准液、控制物溶液、病人标本或混合血清均可分析物浓度：在具有决定性意义的浓度重复次数：20次以上（一）重复性试验第32页，共77页。第33页1.试验样品 一般选择2个，一个在参考区间附近，另一个为异常值2.初步的批内精密度评价：即一个样品重复测定20次，计算出均值，标准差和变异系数。 用2个样品每天测定2批，批间测定间隔不得少于2h，每批平行测定2份，至少共测定20天，80个数据。每对结果间的差（共40个）代表批内差；2批均值

14、之间的差（共20个）代表批间差；每天4个结果的均值（共20个）代表日间差。每批测定至少做一个质控。 第33页，共77页。精密度精密度图 精密度图（precision profile） 以分析物浓度为横坐标，以SD或CV为纵坐标绘制的一条函数关系曲线。 分析物浓度与标准差/变异系数关系图第34页，共77页。第35页（二）回收试验 所谓回收即评定方法正确测定加入常规样品中的纯分析物的能力。即在未知浓度的常规样品中加入一定量的待测组分，检测加入前后该组分的增加量，实际增加量与理论加入量的比值就是回收率。目的是测定比例系统误差 。 第35页，共77页。目的：分析比例系统误差方法:基础管回收管XX+b结

15、果:回收量=回收管量-基础管量 回收率=（回收浓度/加入浓度）100%回收试验第36页，共77页。回收试验举例：偶氮法测定血清钙的回收试验样品制备：1号：基础样品 血清2.0ml+蒸馏水0.1ml2号：低浓度回收管 血清2.0ml+4mmol/L 钙标准液0.1ml3号：高浓度回收管 血清2.0ml+25mmol/L钙标准液0.1ml结果与计算： 2号管加入浓度：40.1/（2.0+0.1）=0.19mmol/L 3号管加入浓度：250.1/（2.0+0.1）=1.19mmol/L基础样品低浓度高浓度第37页，共77页。钙回收试验结果(单位mmol/L)样品管测定浓度加入浓度回收浓度回收率1号

16、管2号管3号管平均1.701.882.850.191.190.181.1594.75%96.6%95.7%理想回收率为100%。该试验比例误差为4.3%。第38页，共77页。注意事项：操作要规范,准确吸量,仪器性能和试剂要好；加入标准液后 最好使试验样品的被测浓度达到医学决定水平浓度；加入标准液体积要小，一般在10%以内，浓度要高;重复次数要适当,样品中加入标准液后计算平均回收率 。第39页，共77页。第40页（三）干扰试验干扰是指在测定某分析物时，受其他非分析物的影响而导致测定结果增高（正干扰）或降低（负干扰）。根据干扰的产生原因分为：基质效应、非特异反应、外部干扰物等。干扰试验的设计同回收

17、试验，即将不同浓度的干扰物代替纯标准品。一般规定只对胆红素、血红蛋白、脂类做干扰试验。干扰值加入干扰物后的测定值基础测定值 第40页，共77页。目的:也是衡量候选方法的准确度，在加入一定浓度的干扰物的条件下，形成的是恒定系统误差干扰物:被试验的物质具有临床意义,常分析胆红素、血脂、蛋白、防腐剂、抗凝剂等干扰物浓度:接近正常水平，具有临床意义干扰试验第41页，共77页。方法：似回收试验基础管干扰管XX+b结果：计算干扰值和干扰率： 干扰值=干扰管浓度-基础管浓度 干扰率=干扰值/基础管浓度100%第42页，共77页。注意事项：准确吸量；加入干扰物的浓度应达到病理标本最高浓度；加入干扰物的体积要小

18、，一般在10%以内；医学决定水平浓度。第43页，共77页。目的：检测系统分析误差，包括比例系统误差和恒定系统误差方法：侯选和比较法同时进行，比较方法的选择要科学注意事项：试验样品数；重复分析；有时间间隔，每次测定2-5个样品，约测定20天；统计处理：（四）方法比较试验第44页，共77页。第45页（五）线性试验线性试验用来评价剂量和反应之间的线性关系，并把呈直线部分确定为线性范围（linear range）。线性范围指检测信号与被测物浓度呈线性时的被测物浓度范围。 1.样品浓度 线性评价至少应有5个不同浓度，可选择低值和高值样品各一份，低值样品和高值样品分别按体积3：1混匀、等份混匀、1:3 混

19、匀，形成5个不同浓度。2.试验方法 将不同浓度的样品（X），随机排列，每个样品重复测定4次（Y），并要求在当天完成所有分析。 第45页，共77页。分析测量范围和线性 线性（linearity）是指在分析测量范围内，测量值与预期的分析物浓度（或活性）在数学上有明确的直线关系。 线性范围（linear range）是指测量值与预期的分析物浓度（或活性）呈直线关系的范围。 线性范围、可报告范围和分析测量范围是不同组织或专业团体对检测系统或方法在一定范围内给出可靠检测结果能力的描述，表述方式不同但内在含义一致。第46页，共77页。分析测量范围和线性 分析测量范围（analytical measurem

20、ent range） 又称为测量区间或可报告范围，是指在不进行任何稀释、浓缩或其它预处理等情况下，测量程序直接测量样本，测量结果不精密度和偏倚在允许范围内的分析物的浓度（或活性）范围。 临床可报告范围（clinically reportable range) 是指对样本进行稀释、浓缩或其他预处理，以扩展直接分析测量下的分析物浓度（或活性）范围。第47页，共77页。分析测量范围和线性 线性评价方法 线性评价是将样本进行系列稀释，或使用（具有已知值/已知关系的）线性评价材料，对测定值与指定值或稀释值进行回归分析，评价该方法能准确报告的最低、最高的浓度范围，即建立定量测定方法的分析测量范围（线性范围

21、）。 第48页，共77页。1.方法学性能标准及其制定（1）性能指标：应根据不同的应用目的（筛选、诊断、预后、监测）而异。由允许分析误差EA和医学决定水平Xc这两项内容决定。方法性能判断第49页，共77页。允许分析误差（allowable analytical error EA ）：指95%样品的允许误差限度；医学决定水平（medical decision level）：用Xc表示，是临床判断结果具有意义的被分析物浓度。第50页，共77页。（2）性能标准：制定的性能标准，既应反映临床应用与解释结果的要求称为医学效用限度（medical usefulness limits），又应基本符合实验室所能

22、达到的技能状态（state of art）。第51页，共77页。第52页系统误差误差分类评价试验评价指标理想结果比例系统误差回收试验Ea1/2TEa恒定系统误差干扰试验干扰值1/2TEa比例系统误差方法对比试验Y=a+bXXc-Yc 1/2TEa随机误差重复性试验（批内、批间、日间）、总不精密度总随机误差1/3TEa 三、 方法学性能判断第52页，共77页。第53页表2-3 临床生化检验方法的误差及评价方法系统误差误差分类评价试验评价指标理想结果比例系统误差回收试验回收率95-105%恒定系统误差干扰试验干扰值接近0比例系统误差方法对比试验Y=a+bXb接近1.0恒定系统误差a接近0随机误差重

23、复性试验（批内、批间、日间）、总不精密度CV3%二 方法学性能评价内容第53页，共77页。第三节 校准和溯源性第54页，共77页。参考区间1.概念建立参考区间的流程从参考个体组成的参考人群中，选择一定数量的参考个体组成参考样本组通过测定某个指标获得该组所有个体的检测结果（即参考值 ）经过统计处理获得参考值的分布状态（正态或偏态）并计算参考限第55页，共77页。参考区间根据参考限确定参考区间。 参考限：通常设定为包含中间95%的参考值。大多数项目以参考值分布的2.5%为下限，97.5%为上限；如果只有单侧参考限具有临床意义，可以确定5%或95%为参考限。第56页，共77页。参考区间1.概念 参考

24、区间（reference interval）即参考上限和参考下限之间的参考值分布范围。对于单侧参考限有临床意义的项目，如参考上限，则参考区间为0参考上限。 第57页，共77页。基本概念1.校准 概念：在规定条件下，为确定测量仪器或测量系统所指示的量值，或实物量具(包括参考物质等)所代表的值，与对应的由标准所复现的量值之间关系的一组操作。 临床检验中的校准： 在规定条件下，通过测定已知浓度/活性的分析物（即校准品/标准品），建立试剂/仪器系统与分析物浓度/活性之间关系的过程。 校准函数 测量函数第58页，共77页。基本概念2.溯源性 概念： 指测量结果或标准量值的属性，它使测量结果或标准量值通过

25、一条不间断的比较链与给定的参考标准联系起来。第59页，共77页。基本概念国际单位制(SI)单位(基本或导出单位）国际通用，是溯源链最高等级仅2530种化学定义明确的小分子化合物 有国际约定的参考测量程序和国际约定的参考物质 有国际约定的参考测量程序，但无参考物质 有国际约定的参考物质及定值方案，但无参考测量程序 既无国际约定的参考测量程序，也无参考物质。不能溯源至SI单位溯源至SI单位 3.溯源性类型 第60页，共77页。参考测量系统2. 参考测量程序 概念：是经过充分研究的测量程序，给出的值的测量不确定度适合其预期用途，尤其 是评价测量相同量的其他测量程序的正确度和描述参考物质特性的用途。

26、分级：一级参考测量程序( primary reference measurement procedure)是具有最高计量学特性的参考测量程序，其操作能够被充分描述和理解，可用国际单位制单位表示完整的不确定度，结果无需参考相同量的测量标准而被接受。 适合一级参考物质(纯物质)的鉴定，不适合生物基质样本的分析 二级参考测量程序(secondary reference measurement procedure)是经充分论证，由一或多个一级参考物质校准的测量程序，其不确定度能满足特定要求，能用于低一级测量程序评价和参考物质定值。 适合复杂生物样品分析 “参考方法”第61页，共77页。参考测量系统3.

27、参考实验室 参考测量实验简称参考实验室，是运行参考测量程序、提供有给定不确定度的测量结果的实验室。 参考实验室有很高的技术和管理要求，需要通过特定的程序才能成为参考实验室。 对于同一检验项目，参考实验室形成网络并定期进行测量比对，以保证参考测量的有效性。第62页，共77页。质量目标的设定方式评估分析性能对具体医学决定的影响评估分析性能对一般医学决定的影响专业建议或指南提出国家法规或室间质量评价组织提出根据当前技术水平设定与临床需要相关的密切程度下降质量目标的设定方式第63页，共77页。溯源链的结构与工作原理 1. ISO/DIS 17511溯源链 计量机构参考实验室制造商终末用户第64页，共7

28、7页。参考物质的互换性和基质效应 1. 参考物质的互换性 概念：指用常规方法和参考方法测量参考物质所得结果的数字关系，与上述方法 测量实际临床样品所得结果的数字关系的一致程度，直接影响量值传递的正确性。2. 产生参考物质互换性问题的原因 (1)分析物的存在形式不同 制备参考物质时使用动物来源的样本或添加外源性分析物 互换性随着分析物浓度增大而变差 （2）基质效应 指被测量以外的某种样品特性（简称影响量）对测量及被测量的值的影响。 分析干扰：影响量本身不产生测量信号，但它增大或减小被测量的测量值。 测量过程的非特异性：影响量本身产生测量信号。第65页，共77页。参考物质的互换性和基质效应 产生参

29、考物质互换性问题 参考物质互换性问题的处理 （1）选择基质与实际样品尽量接近的参考物 （2）选择分析特异性较好、对基质不过分敏感的常规测量方法。（3）进行量值溯源的确认，以判断参考物质的互换性是否影响量值传递的正确性。 （4）参考物质的互换性不可接受时，需进行修正或选择其他参考物质。 分析物的存在形式不同 基质效应 （1）参考物质的加工处理（2）参考方法与常规方法的检测原理不同 第66页，共77页。第四节 测量不确定度第67页，共77页。基本概念 测量不确定度 是一个与测量结果有关的非负参数，能够合理地表征赋予被测量量值的分散性。 标准不确定度分量 测量结果的不确定度往往有多个来源，对每个不确

30、定度来源评定的标准差，称为标准不确定度分量。 合成标准不确定度 当测量结果是由若干个输入量求得时，测量结果的标准不确定度由各输入量的标准不确定度用方差和/或协方差方法合并得到，称为合成标准不确定度。 扩展不确定度 又称“总不确定度”，是确定测量结果区间的量，合理赋予被测量值在一定概率下包含于此区间。 第68页，共77页。基本概念 测量不确定度的评定： （1）A类评定 对在规定测量条件下测得的量值用统计分析的方法进行的测量不确定度分量的评定，其结果可以用标准差表征。该类评定需要在规定条件下进行多次重复性或复现性试验，从而得到一组或多组观测列并对观测列进行统计分析，其结果较客观、可信。 （2）B类评定 并非由统计方法评定，而是根据经验或其他信息假设的概率分布估算的标准不确定度分量，也可用标准差表征。该类评定需要有可靠的数据来源，或有充分的经验、专业知识以及理论分析能力，方法简单，但主观性、经验性较强。 A类评定不可用时，可考虑采用B类评定。 无论A类评定还是B类评定都应注意不能遗漏分量，也不能重复计算分量。第69页，共77页。测量不确定度的评定方法 年份发