天然药化实验print

1、 天然药物化学实验指导何祥久，刘一品编写武汉大学药学院2009年6月天然药物化学实验规则实验前必须预习实验内容，了解实验原理和操作规程。随时记录实验项目及其现象，以撰写正式实验报告。实验前应清点并检查仪器是否完整，装置是否正确，合格后方可进行实验。实验时不准做与实验无关的事情，严禁吸烟，不得擅自离开实验室，并应随时注意反应情况，仪器是否漏气、破裂等。药品仪器都须节约爱护使用；公用物品，用后立即放归原处，以便他人使用。不可调错瓶塞，以免污染。器皿用后要洗刷干净。操作易燃性有机溶剂，回流、蒸馏、减压蒸馏时，不能明火直接加热，要放沸石或一端封死的毛细管。若在加热时发现未放沸石则应冷却后再加，防止爆沸

2、冲出。减压系统应装有安全瓶。加液时应停火或远离火源，勿漏气开口，冷凝水要通畅。启封易挥发溶剂瓶盖时，脸面要避开瓶口慢慢开口，以防气体冲脸上，危机尊容。有毒、腐蚀性药品应妥善保管，操作后要立即洗手。勿沾及五官、创口及身体暴露部位，以免中毒、损伤皮肤。实验中，应在通风橱中使用毒气或腐蚀性气体，必要时，可戴防护用具进行工作。若将玻璃管插入塞中时，可在塞孔中涂些水或甘油等润滑剂，用布包住玻璃管使其旋转而入，防止折断割伤。实验台上勿放置与实验无关物品，随时保持水槽、仪器、桌面、地面整洁。实验结束时，应将门、窗、水、电、煤气关好，室内打扫干净，并清点仪器后方可离开实验室。10实验室常见的事故如下，应予以特

3、别注意：蒸馏或回流时，发现未放沸石，未等溶液冷却就补加沸石，结果溶液冲出瓶外，容易引起火灾。蒸馏易燃物时，未通冷却水，大量蒸气逸出易引起火灾。蒸馏易燃物时塞子漏气引起火灾。用三角烧瓶做减压装置的受器，结果炸裂。减压操作结束后，放气太快，使压力计冲破。使用真空干燥器时，未关闭真空泵就直接开干燥器的放气阀，结果使泵内的机油被吸到干燥器中，使样品被污染等。天然药物化学安全防火须知实验室存放易燃性有机溶剂时要远离火源，存量不得超过500mL。在进行易燃性有机溶剂实验时，须按照操作规程进行。不可将易挥发、易燃性有机溶剂倒入水槽或废液缸内。烘箱内不能烘盛有易燃性溶剂的器皿。消防器材、砂箱、石棉布、灭火器等

4、应放在方便固定的地点，不能随意移动，均应处于备用状态。万一不慎着火，要沉着冷静积极抢救。应立即切断室内电源和火源，用石棉布将着火部位盖严，使其隔绝空气而熄灭。或视火势情况选用适当灭火器材进行灭火。在实验室使用二氧化碳灭火器较好，它具有不腐蚀、不导电等优点。1实验一氧化苦参碱的提取分离和鉴定1概述中药苦参是豆科植物苦参(Ait)的干燥根，有清热燥湿、杀虫、利尿之功效。苦参在临床上用于杀虫、治疗痢疾、肝炎、荨麻疹、湿疹、气管炎等。药理实验证明苦参总生物碱有抗心律失常及抗癌活性等。苦参中主要含生物碱和黄酮类成分苦参中主要生物碱有：苦参碱(1)、氧化苦参碱(2)、槐定(3)、槐果碱(4)，结构如Fig

5、.1。氧化苦参碱有抗癌、抗衰老等作用。131289苦参碱o氧化苦参碱槐果碱Fig.1苦参中主要生物碱的化学结构Table1.1主要苦参生物碱的理化性质中英名称分子式性状mp()旋光溶解度苦参碱(matrine)C15H24N2O白色针状结晶76+39.11易溶于醇、氯仿，溶于乙醚、苯，难溶于水氧化苦参碱(oxymatrine)C15H24N2O2白色方晶207-208+47.7易溶于水、乙醇、甲醇、氯仿，不溶于乙醚、苯槐定(sophoridine)C15H24N2O白色棱晶106-108槐果碱(sophocarpine)C15H22N2O白色棱晶80-81-29.44同上从苦参中提取生物碱一般

6、用水、酸水或醇提法，粗提物用树脂法或酸碱法纯化，分离方法多用氧化铝或硅胶柱层色谱。实验目的与要求掌握渗漉法的原理、操作与影响因素，了解离子交换树脂的结构、性质及使用方法掌握连续回流提取法的原理、特点及仪器的使用方法。学习粗提物的纯化方法，学会分析纯化过程中所应用的原理。进一步理解对粗品进行检识的意义及方法。操作步骤3.1实验装置图Fig.1.2实验装置图3.2离子交预将70g聚烯磺脂杯中，加200ml80的蒸馅水溶胀30分钟，倾馏水后加入-imo搅拌，放置半小时（静态转型），后装入树脂柱00mr使全柱（动态转型），流出液的速度以液滴不成串为_*/、i、至一柱到洗涤过程中始终保持液面高于树脂床。

7、113.3总生物碱的提取与纯化称苦参根的粉末200g，加入260ml左右0.5%的盐酸湿润，搅匀，放置20分钟后装入渗漉筒，加入适量0.5%盐酸至下口有溶液流出且筒内无气泡。将渗漉筒与树脂柱相连，计算渗漉速度。然后以合适的流速开始渗漉和离子交换，实验开始时及每过1小时之后检查渗漉液和交换液的pH值和生物碱反应，并讨论其变化的原因。当生物碱提取完全或树脂完全饱和时终止实验。停止渗漉后，用蒸馏水洗树脂至中性，倾出水层，将树脂倒入搪瓷盘中，铺平，空气中晾干。将晾干的树脂称重后放入烧杯中，加14%的氨水湿润(使树脂充分溶胀又无过剩的水)，加盖，静置20分钟，装入沙氏提取器，用300ml95%乙醇回流提

8、取生物碱约6小时，中间注意检查生物碱是否已被提取完全。停止实验后，将树脂回收，提取液置500ml三角瓶中保存。氧化苦参碱粗品的获得将乙醇提取液常压回收乙醇至小体积(6ml左右)，加入70ml80ml氯仿溶解，转入分液漏斗中，静置分层，分出氯仿层，油状物另外保存。氯仿溶液用无水硫酸钠干燥12小时(注意干燥过程中经常振摇)，回收氯仿至干。残留物用丙酮析晶，即析出黄白色固体，放置，抽滤，用少量丙酮洗涤，得氧化苦参碱粗品，交给老师，放干燥器中干燥，母液放置待用。氧化苦参碱粗品用丙酮重结晶可得其精品。4.生物碱的定性试验4.1取渗漉液1mL，加硅钨酸试剂(Bertradsreagent)数滴，产生淡黄色

9、沉淀4.2取渗漉液1mL，加碘化钾试剂(Wagnersreagent)数滴，产生棕褐色沉淀4.3取渗漉液1mL，加碘化铋钾试剂(Dragendorffsreagent)数滴，产生棕红色沉淀5氧化苦参碱的分离5.1薄层分析方法：硅胶HF254-CMC碱性薄层，调合剂为0.5%CMC溶液一4%NaOH(9:1)，(5x15cm2,4块/人)展开剂：氯仿一甲醇(4:1)氯仿甲醇氢氧化铵（5:0.6:0.3下层）氯仿一甲醇一氢氧化铵（10ml:1.2ml:2滴）氧化苦参碱的分离纯化制备性薄层色谱法：玻璃板：20 x20cm2硅胶HF25：20g调合剂：同粗品检识项下，用量为60ml左右。样品：氧化苦参

10、碱粗品300mg展开剂：自选，用量250ml/4人显色方法：自定。洗脱：将氧化苦参碱色带刮下，装入洗脱柱，以氯仿一甲醇（7:3）混合溶剂洗脱至无生物碱为止，回收溶剂。残留物用丙酮溶解，过滤，回收丙酮至少量，放置，待析晶完全，滤集结晶、干燥。注：氧化苦参碱后面色带刮下，交老师。闪柱色谱法：色谱柱规格：2x50cm吸附剂：230-400目闪柱硅胶35g压力：0.30.5kg/cm2样品：120mg氧化苦参碱精品溶于1ml氯仿中，湿法上样。洗脱剂：氯仿一甲醇一氢氧化铵（5:0.6:0.3）（充分振摇后，静置，用下层）。洗脱：每5ml一流份，用硅胶碱性薄层检识，合并单一色点流份，回收溶剂，得氧化苦参碱

11、纯品。6氧化苦参碱的结构鉴定（1）纯度检查：用TLC法，条件自选。（2）测定mp（3）测定产品的IR、MS、1H-NMR谱。7思考题7.1叙述酸水法及离子交换法提取纯化生物碱的原理。应如何检查渗漉液中是否含有生物碱？渗漉液中生物碱是否被交换在树脂上？离子交换树脂是否已饱和？7.3简述沙氏提取器提取原理及特点。什么叫闪柱色谱？其有何优缺点？制备性薄层色谱的特点是什么？简述提取、分离和鉴定生物碱的程序并分析所测氧化苦参碱的各种波谱数据。参考文献白世泽等中草药，1982：13(4)，8张守芳中草药通讯，1977(1)：38；(2)：39AUenoetalChemPharmBull1978，26，18

12、32陈德昌中药化学对照品工作手册北京：中国医药科技出版社，2000：142杨云等天然药物化学成分提取分离手册北京：中国中医药出版社，2003：454 1实验二:芦丁的提取及鉴定1概述芦丁（Rutin）广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、养麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物的未开放的花蕾）和养麦中含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。芦丁是由槲皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖脱水缩合形成的苷。芸香糖（Rutinose）为葡萄糖（Glucose）与鼠李糖（Rhamnose）组成的双糖。芦丁的化学结构见Fig.2.1所示。Fig.2.1TheStr

13、uctureofRutin芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水的熔点为174-178C,无水物188-190C。溶解度：1:10000（冷水），1:200（热水），1:650（冷乙醇），1:60（热乙醇）,1:12（冷吡啶）。微溶于丙酮、醋酸乙酯,不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚,溶于碱而呈黄色。芦丁的提取方法很多,目前多采用碱提取-酸沉淀法。该法的提取原理是依据芦丁结构中含有酚羟基,能与碱反应生成盐而溶于水中,向此盐溶液中加入酸,则芦丁游离析出。此外,还可以采用水或醇提取法。芦丁具有维生素P样作用。有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，主要用作防治高血压病的辅助治疗（但不能降压）剂

14、,亦可防治因缺芦丁所致的其它出血症。多作口服，也可作注射用。实验目的（1）通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。（2）通过芦丁结构的检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法。（3）学习UV及NMR在黄酮类化合物结构鉴定中的应用。实验要求（1）分离得到芦丁、槲皮素、全乙酰化芦丁；（2）能够根据化学试验及UV、NMR数据初步推断出芦丁的结构，并对利用谱学方法测定黄酮类化合物的结构有基本了解。实验方法及实验内容）（j20ag）p4.1实验流程槐米（置500mL圆底烧瓶中，加水300mL,在搅拌下加入石灰乳，弃去）调至pH8-91，加热套中加热至微沸，盖上滤纸，防止水分过分挥发,

15、但要不时搅拌。保持30min（注意滴加石灰乳维持pH8-9）趁热抽滤在60-70下用浓盐酸调至pH2-3,静置2h,抽滤沉淀（粗芦丁）弃去）重结晶：将一半沉淀悬浮于70倍蒸馏水中, #1 #1加热煮沸15min,趁热过滤弃去）充分静置2h,过滤,干燥 #1 #1芦丁（精制） 1注意:加入石灰乳即可以达到碱溶解提取芦丁目的,尚可除去槐花米中的大量多糖类粘液质。但pH不能过高,否则钙能与芦丁形成螯合物而析出沉淀。pH过低会使芦丁形成钅羊（音Yang）盐而降低收率。利用芦丁在冷热水中溶解度的差别可达到结晶之目的。得到的沉淀要粗称一下,按照芦丁在热水中1:70的溶解度加蒸馏水进行重结晶。芦丁的鉴定4.

16、2.1.芦丁的定性反应取芦丁34mg,加95%乙醇5-6mL使溶，分成三份做下述试验：（1）取上述溶液1-2mL,加2滴浓盐酸,再酌加少许镁粉,注意观察颜色变化情况.（2）取上述溶液1-2mL,然后滴加2%ZrOCl2的甲醇溶液，注意观察颜色变化情况；再继续向试管中加入2%柠檬酸的甲醇溶液,详细记录颜色变化情况.（3）-萘酚反应（MolishsReaction）取上述溶液1-2mL,加入等体积的10%-萘酚乙醇溶液，摇匀，沿管壁滴加浓硫酸，注意观察两液界面产生的颜色变化.Notes:在样品溶液中加入2%ZrOCl2的甲醇溶液之后,如溶液呈黄色示结构中可能含有C3-OH或C5-OH。再加入2%柠

17、檬酸甲醇溶液,黄色不褪示有C3-OH;如黄色褪去,加水稀释后转为无色，示无C3-OH,但有C5-OH。（上述两种条件下生成的锆络合物因对酸的稳定性不同，其中C3-OH、4-酮基络合物的稳定性大于C5-OH、4-酮基络合物.）芦丁水解后糖与苷元的鉴定（1）水解方法精密称取芦丁粗品0.5g（0.01g），加2%硫酸35mL，加热沸腾40min，用滤纸盖上，以免过分挥发。放冷静置过滤。所得沉淀用少量水（除酸），干燥称重，计算苷元与糖的重量比。然后再用95%乙醇（大约10mL）重结晶即得苷元。（母液可供作糖的纸层析鉴定）取芦丁精品，水解苷元，十乙酰化产物及芦丁标品少许，溶于95%乙醇中，点样于聚酰胺薄

18、膜上，以75%乙醇展开。层析展开至一定距离，分别在日光，紫外灯下观察，记录现象。再熏少许氨水，观察现象并记录。喷AlCl3显色，并记录现象。分别计算各样品的Rf值，说明理由。注释：1干燥称重得苷元0.5g（此时干燥得的苷元含2个结晶水）。若按照苷元与糖的比例为1:2时，应得苷元的理论值为0.5086g。若在95-91之间干燥则得脱水苷元（脱水苷元的理论值为0.454g）。（2）苷元的鉴定通过苷元的化学降解（Fig.2.2）、UV光谱以及乙酰化衍生物的制备，检识其结构。苷元碱降解与降解产物的纸层析鉴定取苷元50mg,加水和95%乙醇各5mL,以氢氧化钾4g在石棉网上直火加热回流5小时反应后挥去醇

19、。然后，用稀盐酸调成酸性（pH大约在2左右），再用乙醚振摇萃取。取醚层回收醚，残液进行缓冲纸层析。然后用Sulphanilicacid1试剂显色，并与间苯三酚和原儿茶酸的标准品对照，层析结果如注2所示。注释:1:SulphanilicacidT.SA液：10%Na2CO3水溶液B液：0.5%SulphanilicacidC液：0.5%NaNO3水溶液显色程序：先喷A液，然后再喷B和C的等量混合液（B和C用时临时混合）2：苷元碱降解产物的层析展开剂：水饱和的正丁醇，滤纸在展开前要用pH=9的缓冲溶液处理。OHOHOOHOH-HeatingOHOHOHOHVohCOOHPhloroglucinol

20、Protocatechuricacid #1 #1Fig.2.2TheProductsofDegredationofQuercetin 1苷元的UV光谱解析取苷元溶于甲醇中，加规定试剂(见附录)测得UV光谱，判断其结构。并根据苷与苷元的UV光谱的差异判断糖与苷元的连接位置。苷元乙酰化物的熔点测定取苷元200mg，置于干燥的50mL锥形瓶中，加5mL醋酐用滴管滴加浓硫酸Id，振摇使完全溶解，接空气冷凝管，水浴加热30，放冷，搅拌下将反应液倾入lOOmL冰水中,搅拌至油滴消失为止。抽滤并洗涤沉淀，干燥后以95%乙醇重结晶。测得苷元乙酰化物的m.p.与槲皮素五乙酰化物的熔点(193C)致。糖的鉴定将

21、上述水解母液10mL小心用Ba(OH)2(大约1-1.5g)细粉中和至中性，滤出生成的BaSO4沉淀，滤液置蒸发皿中水浴缓慢蒸干，再加少许95%乙醇溶解后,取样，围绕弧线，对称点于滤纸上，并用葡萄糖、鼠李糖标准品作对照，以正丁醇-醋酸-水(4：1：)作径向展开。晾干后显色。显色剂：邻苯二甲酸苯胺，喷洒后在105C下加热3-5分钟。观察结果，计算Rf值并记录。实验要求.芦丁提取方法，重点介绍碱酸法的原理及注意事项；.定性实验的目的、意义及注意事项；.掌握碱酸法提取芦丁的原理及注意事项；.定性反应的反应机理；实验结果及记录.详细记录定性反应结果；.绘制层析结果模拟图并计算Rf值；.分析UV与NMR

22、光谱；.分析讨论实验结果(成功、失败的原因)。思考题.苷类结构的检识程序如何？.苷类水解有几种催化方法？.怎样确定芦丁结构中糖基与槲皮素3-0-位置相连？.怎样证明芦丁分子中只含有一个葡萄糖及一个鼠李糖.苷元的结构是怎样确定的？8仪器设备烧杯500mL2个空气冷凝器1个烧杯250mL2个玻璃漏斗2-3cm1个锥形瓶50mL2个干燥箱锥形瓶25mL3个水浴锅1个布氏漏斗2个滴管1支试管10mL3支分液漏斗250mL1个玻棒1支层析槽1个9实验材料及试剂槐花米20gKOH化学纯镁粉少许Ba(OH)2化学纯CaO化学纯葡萄糖标准品无水吡啶化学纯鼠李糖标准品醋酐化学纯浓硫酸分析纯95%乙醇分析纯浓盐酸

23、化学纯10实验安排第一次：(1).芦丁提取分离.芦丁的定性反应第二次：(1)芦丁的水解(2)糖的鉴定实验三:大黄中蒽醌类成分的提取分离1概述大黄记载于神农本草经等许多经典文献中，用于泄下、健胃、清热、解毒等。自古以来，大黄在植物性泻下药中占有重要位置，是一味很早就被各国药典收载的世界性生药。大黄的种类繁多，优质大黄是蓼科植物掌叶大黄(RheumpalmtumL),大黄(R.officinaleBaill)及唐古特大黄(R.tangutiumMaxim.etregll)的根茎及根。大黄中含有多种游离的羟基蒽醌类化合物及其与糖所形成的苷。羟基蒽醌母核及主要蒽醌类化合物如 #1 #1Fig.3.1所

24、示。R2 #1 1Fig.3.1TheStructureofAnthraquinonesinR.officinaleNameofCompoundsRiR2CrytalsM.P.()大黄酸(Rhein)HCOOH黄色针状318-320大黄素(Emodin)CH3-OH橙色针状2567芦荟大黄素(Aloeemodin)HCH2OH橙色细针状20620大黄素甲醚(Physcion)CH3-OCH3砖红色针状207大黄酚(Chrysophanol)HCH3金色片状结晶196大黄中蔥醌苷元，其结构不同，因而酸性强弱也不同。大黄酸含有一COOH,酸性最强。大黄素为酚b-OH,酸性第二，芦荟大黄素连有醇-O

25、H,酸性第三，大黄素甲醚有-OCH3，大黄酚有-CH3，该基团不是酸性基团，但因母核具有1,8-二酚羟基，所以也具有酸性，排列第四。根据这些特点，一般分离方法用梯度碱度萃取法。蒽醌类化合物在植物体内主要以苷的形式存在，其中有：大黄酸葡萄糖苷、大黄素甲醚葡萄糖苷、芦荟大黄素葡萄糖苷、大黄素葡萄糖苷、大黄酚双葡萄糖苷。此外，新鲜大黄中还含有属于双蔥酮的番泻苷A及B等。本实验先用酸水将蒽苷充分水解为总蒽醌苷元，再用不同的pH碱液分步萃取，以分离不同酸度的苷元。2实验目的根据所学理论知识和基本操作，设计分离大黄中所含5种主要蒽醌的最简洁可行的实验方案。3实验方案通过系统查阅文献，自行设计实验方案，在实

26、验前3天提交实验老师审核，确认后进行再进行实验。考核指标(1).分离得到纯化合物的个数、纯度：百分比：60%(2).实验方案的合理性、简洁性：百分比：30%(3).实验进度：百分比：10% 1实验参考资料(1)大黄总蒽醌苷元的纸层析为了解总蒽醌苷元的所含成分，进行如下纸层析实验。取新华滤纸，距离下端2厘米处划一起始线，点样总提取液就及5种标准品，用8-10mL甲苯为展开剂上行展开，用5%K0H显色，与各标准品对照，Rf=0.98是大黄酚和大黄素甲醚的混合物。Rf=0.70是芦荟大黄素，Rf=0.00是大黄酸。Rf0.980.700.400.00(2)蒽醌类成分的缓冲纸层析实验为了分离以上4种成

27、分，进行缓冲纸层析实验，以确定最佳分离条件。缓冲滤纸的制备：取新华滤纸，22x14cm离下端2cm处划一起始线，再每隔1cm划纵向平行线，每一条带处，顺次涂以不同的pH缓冲液和碱液，涂完后，将湿滤纸夹在两张干滤纸之间至半干，在每一条pH条带原点处，点加总蔥醌苷元提取液。用水饱和过的氯仿20mL为展开剂上行展开，当溶剂上升到5到7cm时，取出，烘干，KOH显色，层析结果如Fig.3.2所示。123456789101112131415161718192021OO0OO0O08O0OOOIIOOO0IIIDOOOO3O3O33OO3Fig.3.2BufferPaperChromatographyof

28、TotalAglyconesinR.officinale在Fig.3.2的纸层析图谱中，可以看到三条S型曲线，其中.为大黄酸，II为大黄素，III为芦荟大黄素，余下为大黄素甲醚和大黄酚的混合物。各条滤纸分别用下述缓冲液或碱液处理:1:pH3；2:pH4；3:pH5；4:pH5.6；5:pH6；6:pH7；7:pH8(以上为柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液);8:pH9(硼酸缓冲液)；9:pH9.19；10:5%NaHCO3；11:pH9.9;12:pH10.83(9、11、12NaHCO3Na2CO3缓冲液);13:0.5%Na2CO3；14:2.5%Na2CO3；15:5%Na2CO3;16，17，18分别为5%Na2CO3：NaOH(9:1,1:1,1:9)；19:5%NaOH水溶液。最佳萃取剂及用量的确定根据Fig.3.2可以确定：萃取大黄酸时以pH8的缓冲液