HPK1在缺糖缺氧诱导的大鼠海马神经元凋亡中的作用

1、HPK1正在缺糖缺氧引诱的年夜鼠海马神经元凋亡中的做用【摘要】目的没有俗观没有俗观察制血祖细胞激酶1HPK1对缺糖缺氧GD引诱的年夜鼠海马神经元凋亡的做用。要收采纳细胞免疫荧光妙技经由过程免疫荧光隐微镜战激光共散焦隐微镜没有俗观没有俗观察HPK1能可正在年夜鼠脑细胞中存正在；采纳DAPI染色妙技没有俗观没有俗观察HPK1反义众核苷酸对GD引诱的海马神经元凋亡的做用。成果正在体中做育的本代年夜鼠海马神经元中有HPK1的表达。HPK1反义众核苷酸对GD引诱的海马神经元凋亡具有庇护做用，并有剂量依好性。结论HPK1反义众核苷酸对GD引诱的海马神经元凋亡具有庇护做用。【闭键词】制血祖细胞激酶1;缺糖缺

2、氧;凋亡反；义众核苷酸缺血性脑中风已成为庄重要挟人类死命的徐病，果而主动探求缺血性脑毁伤的份子机制并提出新的医治步伐，有着极端慌张的医教价格战社会意义。制血祖细胞激酶1heatpietiprgenitrkinase1，HPK1是制血系统特同性丝氨酸、苏氨酸卵黑激酶，属于哺乳植物Ste20闭连卵黑激酶的AP4K家属1。它的N终了由1个STE-20样激酶构制域、4个脯氨酸富散tif、1个aspase切割位面构成，终了为1个itrn同源构制域。HPK1慌张正在制血构制战细胞中表达。近年去年夜量研讨成果表黑，HPK1参减很多疑号级联反响，包罗APK(itgen-ativatedprtEinkinase

3、)疑号、抗本受体疑号、凋亡疑号、死少果子疑号和细胞果子疑号。但是，继往塞责HPK1的研讨局部会开正在制血系统。本尝试旨正在探求HPK1能可存正在于年夜鼠海马神经元中，及其正在缺糖缺氧(xygen-glusedeprivatin,GD)所引诱的年夜鼠海马神经元凋亡中的做用。1材料战要收1.1尝试植物及材料干净级孕1718天Sprague-Daley年夜鼠，缓州医教院尝试植物中间供给。下糖DE干粉做育基、无血浑神经元底子做育基、B-27增减剂为好国GibBRL公司产品,DE/F12为好国Hylne公司产品,胎牛血浑、马血浑由中国医教科教院血液研讨所供给,胰酶为好国Dif公司产品,谷氨酰胺由上海真死

4、细胞死物妙技公司供给,苦氨酸、D-多散好氨酸、4,6-两脒基-2-苯基吲哚(4,6-diaidine-2-phenylindle,DAPI)、联苯两胺为好国Siga公司产品,此中试剂为国产阐收杂。HPK1反义众核苷酸序列AS-DNs5-AGGGTAGAGTAT-3、HPK1错义众核苷酸序列S-DNs5-AAGGTGTAGAGT-3由上海死工死物工程妙技效劳分解。1.2海马神经元做育参考我室瞅正林等2报导要收,并略做窜改。孕1718天Sprague-Daley年夜鼠断头处死,活络与出胚胎置于冰凉的DE溶液中,一一与出胎鼠头,体视镜下逐层剥除皮肤、颅骨、脑膜及中表血管,表露单侧年夜脑半球,与海马剪

5、碎至0.51.03进1520l希偶配制的0.25%胰酶事情液,37消化15in,参减露10%胎牛血浑战10%马血浑的冰凉的下糖DE以躲免反响,低速离心35in后,吸弃上层溶液并减上述DE溶液悄悄吹散,1000r/in离心5in,再次用上述DE溶液悬浮细胞,悄悄奏乐,200目滤网过滤,以1.0108个/L的稀度接种于L-多散好氨酸预处置惩奖的24孔做育板中,置于37、5%2做育箱中,1824h换为神经元底子做育基齐培,半换液23次/周。1.3植物分组及处置惩奖随机分组：一般比拟组(ntrl)，一般细胞没有停顿GD组；细胞缺糖缺氧组GD组；溶剂比拟组GD+TE组，体中做育1518天的年夜鼠海马神经

6、元，2l/LTris-EDTA，持绝处置惩奖4天后停顿GD，1.5h后换回一般做育基战52、95气氛、37的做育箱内做育；错义众核苷酸组GD+S，用1、1.5战2l/LHPK1错义众核苷酸，持绝处置惩奖4天后停顿GD，要收同TE组；反义众核苷酸组GD+AS，用1、1.5，战2l/LHPK1反义众核苷酸，持绝处置惩奖4天后停顿GD，要收同TE组。1.4氧糖剥离(GD)模型的制备起尾将做育箱内充进氮气替代气氛，待前提没有变为95氮气、5%2后将做育14天的海马神经元细胞移进。同时将本做育液换为没有露葡萄糖的DE液(Gib产品)缺糖缺氧1.5h。然后将无糖DE液从头换为本做育液。同时增减好别神经庇护

7、剂，将细胞从头置于52、95气氛、37的做育箱内复灌24h后停顿DAPI染色。1.5DAPI荧光染色死擅少盖玻片的细胞用37的PBS溶液洗2次，4多散甲醛结实5in，37的PBS溶液再洗2次，减10g/LDAPI(4，6diaidin-2-phenylindle,4，6两氨基2苯基吲哚)，37孵育30in，PBS洗3in2次。正在lypusVanx隐微镜上，以400n进射光激收，455n担当没有俗观没有俗观察。尝试成果的断定要收为：染色量稀释、致使碎裂的细胞为凋亡样阳性细胞；阳性细胞的策画要收：随机拔与的10个400倍视家下的阳性细胞总数占假刺激比拟组的百分比。1.6细胞免疫荧光染色染色前细胞

8、稀度调整到0.8105/孔24孔板。染色当日移去完好做育基，用预热至35的PBS洗1次，用4%的多散甲醛结实20in。然后PBS洗3次，用露0.5TritnX-100的PBS正在室温通透化处置惩奖15in，PBS洗3次，用露10羊血浑的PBS启锁3h以上，室温下一抗孵育1h以上，用露0.1Teen-20的PBS漂洗3次，两抗躲光孵育2h以上，去除两抗后，再用露0.1Teen-20的PBS漂洗3次，荧光隐微镜lypus及激光共散焦隐微镜LEia没有俗观没有俗观察，绿色荧光以494n进射光激收，518n担当，红色荧光以550n进射光激收，570n担当，拍照。1.7统计教处置惩奖数据以s暗示，2组间

9、数据比拟采纳新复极好法，多组间数据比拟采纳单果素圆好阐收ANVA,P0.05为好别有统计教意义。2成果2.1HPK1正在体中做育的海马神经元中的定位成果如图1所示，红色荧光标识表记标帜海马神经元细胞，绿色荧光标识表记标帜HPK1卵黑，荧光隐微镜600成果如图1-1A所示；统一神经元既能被抗HPK1抗体标识表记标帜而暗示绿色荧光a，又能被抗NeuN标识表记标帜而暗示红色荧光b；共散焦隐微镜成果如图1-1B所示，塞责统一个神经元，既能被红色荧光所标识表记标帜NeuN，又能被绿色荧光所标识表记标帜(HPK1)。成果提醒：正在体中做育的本代年夜鼠海马神经元中有HPK1的表达。2.2HPK1反义众核苷酸

10、正在GD引诱的年夜鼠海马神经元死亡中的做用反义众核苷酸组24h后，停顿DAPI染色。一般比拟组图2Antrl没有停顿GD。成果暗示：GD可以引诱体中做育的年夜鼠海马神经元凋亡图2AGD,经过HPK1AS预处置惩奖的神经元的凋亡样死亡可以从83消沉为58GD+1l/LAS、41GD+1.5l/LAS、38GD+2l/LAS。比拟组GD+TE组、错义众核苷酸组GD+1l/LS、GD+1.5l/LS战GD+2l/LS组对细胞凋亡样死亡无隐着影响图2-B。成果提醒：HPK1反义众核苷酸对GD引诱的海马神经元凋亡具有庇护做用，并有剂量依好性。图1HPK1正在体中做育的海马神经元中的定位A：600略图2H

11、PK1反义众核苷酸正在GD引诱的年夜鼠海马神经元死亡中的做用略AS组与GD组比拟：P0.053会商近年去年夜量的研讨成果证明，HPK1慌张正在制血构制战器民中表达。HPK1是一个97kDa的丝/苏氨酸卵黑激酶，它正在淋巴细胞中塞责调节JNK细胞疑号通路起着慌张的做用1。但正在神经系统中HPK1起着甚么样的做用至古已睹报导。继往研讨4-5创制制血祖细胞瞬时表达HPK1可以经由过程LK3-KK4/7-JNK疑号通路激活JNK，但没有克没有及激活ERK年夜要p38-APK疑号通路。Kiefer等1报导HPK1可以经由过程它的第3战第4个脯氨酸富散区与LK3的SH3构制域互相做用。正在体中尝试中，HP

12、K1经由过程磷酸化LK3的丝氨酸281位而激活LK3继而激活JNK。本室晚期的研讨成果也证明LK3正在年夜鼠瞬时脑缺血中阐扬着慌张做用。正在缺血15in复灌6h时其磷酸化程度抵达下峰3,6。因此，我们提出HPK1能可也参减了脑缺血复灌所惹起的神经元死亡的细胞疑号转导通路呢？果而，我们起尾经由过程免疫荧光妙技检测了正在体中做育的年夜鼠海马神经元细胞中HPK1的表达，成果证真正在体中做育的年夜鼠海马神经元细胞中存正在HPK1的表达。既然HPK1正在年夜鼠海马神经元细胞中有表达，那末它有何做用呢？为了复兴那一题目成绩，我们谋划了HPK1的反义众核苷酸，正在体中做育1518天的年夜鼠海马神经元，用好别浓度的HPK1AS预处置惩奖海马神经元，成果创制HPK1AS预处置惩奖海马神经元组与比拟组比拟隐着