分离菌的各种培养基

1、人造海水的配方*(引自 Chemical Oceanography ,Second Edition , Millero F J,1996 )*:水&化合物的总重量为1kg.名称质量(X10-3cg)氯化钠氯化镁硫酸钠氯化钙氯化钾重碳酸钠漠化钾硼酸氯化锶氟化钠23.985.0294.011.140.6990.1720.1000.02540.01430.0029?fi waterASW）t人工海水的组成（Lynum and卜旭的昭.1940）如下由MaCI24.477g4.9810gCflCkr H2O1. 1020bKC1(i.6640fiNaHCOj0.1920gKBrSiCl2篇ts水1 O

2、OOrnJ为了避免沉淀的产生，人工海水的各成分需要分别溶解，然后再混合；pH ”.5,可以用浓的氛氧化钠或盐酸来调节.用以上人工海水代替天然海水大大方便了实验室条件下对真菌的培养，使海海洋微生物及其代谢产物-林永成主编2003细菌的分离：牛肉膏蛋白豚琼脂、营养琼脂等是分离细菌的常用培养基，前苏联细菌学家设计的ZOBELL 2216E培养基是培养好气性异养细菌较好的培养基，可培养多种细菌，SIMIDU培养基也常 用于海洋好气性异养细菌的分离，PFENNIGS培养基适用于海洋光合细菌的分离，分离海洋 弧菌可采用TCBS培养基，培养基PH 一般为7.2-7.6,盐度为28到30,培养温度28到37,

3、 培养时间1到7天，注意观察平板菌落变化，1到2天先挑取大菌落，5到7天后再挑取小 菌落，为防止真菌的污染，常在培养基中添加一定的抗真菌抗生素，如制霉菌素、两性霉素、 放线菌酮等。放线菌因生长缓慢且菌落不大，一般不会对细菌的分离产生影响。放线菌的分离：1放线菌是数量最多、最常分离到的G+，JENSEN的研究表明，离海岸越近，在0到1米水 深的底泥样本中，链霉菌占分离的放线菌总数的86%，小单抱菌占12%，其他占2%。2 分离培养基多采用合成培养基（高氏合成一号、精氨酸、天门冬素培养基）和有机培养基（HV、YE、WAKSMAN、 bennett）,高氏合成一号是分离的常用培养基，适合尤其是链霉菌

4、的生长，但细菌和真菌也 大量生长。HV是以腐植酸为唯一碳、氮源的培养基，对小单抱菌、小双抱菌、指抱囊菌、 链抱囊菌的选择性高，但是生长的放线菌形态不完整，难以观察，给挑菌工作带来困难。3抑制剂放线菌酮、制霉菌素可抑制真菌，青霉素、链霉素可抑制细菌，重铬酸钾对真菌和细菌均可 抑制，0 - 005%-0 - 01%是较理想的分离抑制剂，有三个特点：抑制细菌和真菌的生长，不影 响放线菌的正常生长，还可促进一些放线菌抱子的萌发，价格低廉。4样品预处理120干热处理样品1小时能大大减少细菌和链霉菌的数量，而对稀有放线菌影响较少，甚至能利于抱子萌发，由于海洋样品多潮湿，同时抱子对湿热敏感，故采用50到55

5、度的热处理 会促使大部分抱子萌发。化学杀菌剂法杀菌剂苯酚SDS葡萄糖酸洗必泰CG苄索氯氨BC碳酸钙氯化钙富集的放线菌非链霉菌属小单饱菌智囊饱菌小双饱菌非链霉菌属小四饱菌所有放线菌放线双饱菌小四饱菌链饱囊菌差速离心浓缩真菌的分离：到2000年止已认知的海洋真菌仅仅444种，包括177属360种的子囊菌（占81 1%），51 属74种半知菌（占16 - 7%）和7属10种的担子菌（占2 - 2%）选择性富集海水样品可通过浓缩或过滤，用无菌的045知孔径的硝酸纤维素滤膜过滤海水，然后直接 把滤膜放在培养基上培养。分离酵母菌时，可将含50-200 mg/L氯霉素的分离培养基用浓盐酸调PH值至3 4酸性

6、条 件下可抑制很多细菌生长。植物内生真菌分离方法：进行分离前，对植物材料表面进行彻底消毒非常必要，典型的消毒剂有70%-90%的乙醇、漂 白剂、1%的过氧乙酸和3%-30%的过氧化氢，多采用PDA培养基，并加入庆大霉素、氯霉素、 链霉素等抗生素，抑制细菌和放线菌的生长。鉴定：16S rRNA相对分子量适中，易于进行序列测定和分析比较，可以为细菌鉴定提供相对稳定 可靠的信息，广泛用于评价生物遗传多态性和系统发生关系。18S rRNA成为目前研究真菌 属物种多样性的分析比较。原核微生物rRNA包含23S、16S、5S，真核微生物转录区包含5S、 18S、 5 - 8S、 28S。（C+G）mol%

7、在种内不超过4%,属内不超过10%。低于2%没有分内学意义。只具有否定价值， 需与表型特征相结合。16S rDNA成为细菌种属鉴定和分类的标准方法，适用种及种以上的分类单位。同源性395%的菌可归为同一属，397%可视为同一种，大于97%时必须测定DNA-DNA杂交率 是否大于70%才能确定是否为新种。由于对同种内的不同菌株分辨力较差，更适合研究属及 属以上的菌株。18S rDNA普遍用于真菌物种的鉴定分析。植物内生真菌的分离 叶、叶脉、茎、树皮（韧皮部）等样品用自来水冲洗掉泥土，然后进行 严格的表面消毒程序：依次浸泡在75%酒精lmin，3%一5%有效氯的次氯酸钠溶液3 min。75%的酒精

8、O. 5min，然后再用无菌水冲洗3遍。晾干后，在超静台将其剪成约O. 5cmX0. 5 cm左右小片。将处理好后剪成的小片铺于PDA平板上，加入氯霉素与链霉素各50斗g/mL抑制 细菌的生长，在26培养培养23周分离内生真菌。这些平板在第1周要每天检查1次，然后 可以3、4d检查1次。一旦发现有菌丝从组织小块长出，应马上将其转接到另一新的平板上， 经几次纯化保存于PDA斜面。植物组织样品处理：将采集的红树林植物样品先用流动的清水冲洗干净，再超声清洗彻底去 除植物组织表面的杂质，把植物样品剪切成15 cm左右长度的节段进行表面消毒。样品依次 用次氯酸钠（含5%有效氯量）浸泡5 min,无菌水清

9、洗3次，75%酒精浸泡3 min,无菌水清洗3 次，晾干，用粉碎机把植物组织粉碎备L3. 1各种样品预处理方法样品悬浮品的直接制直,称瑕2 g样品（海生动植物体用无菌剪刀剪碎）到20而的无菌海水中，旋涡振荡10 mi几使其充分混悬，法处理样品6回称取2 &祥品（海生幼植物体用无菌剪刀5!碎）到20 mL含有0, 05 % SDS JIJ 6 %酵母膏的无菌海水中，振荡3-5min后，200 rmm 下振荡 30 min.苯酚法处理样品（闾：称取2 &律品（海生动植物体用无菌曲刀曲砰）到含有1. 5 %苯酚的20 mL的无菌海水中*振荡3-5 min后，3。亳、200 rminT振荡30 mi

10、n*加热法处理样品将直接制备好的样品悬浮液55C水浴6诫值（或50T2, 1 h）注意:：样品处理的整个过程必须是天凿的表1-1菌种分离筛戢所用到的增罪基名称配方%酵母粉麦牙膏琼脂(YE) 1121酵母粉。,4,麦芽骨1,葡萄糖0.4,琼麻2,陈海 水 7M 蒸憎水 25, pH： 7.2-7.4淀粉-干酩素琼脂(SC)5可洛性淀粉1, 干酪素0.03. KMOi 0.舞，NaCl Oh 2, KjPVi 0.2, MgS 7印。0.00&. CaCOi 0.002. PeSO. 0.001,琼脂2,放线菌酮 商口伽 陈海水花.蒸慵水舞.pH: 7. 2-7.4葡萄糖-天门黑既氨琼脂CGA)灿

11、5荀萄摭L 天口窸觥氮口.0瓦 嶙酸氢二钾0.05, 琼脂丸 陈海布，蒸憾水25， pH: 7.2-7. 4腐殖酸-艳生素琼脂HV啊淀粉-蚩白腺琼脂(Ml)葡萄糖-蛋白腌(Martin) 1，fl|淀粉-黄豆粉渔体发酵培养基 (SLM) 1,41腐殖酸 0, 肱HP& 0.005, KC1 0 17 . 腿S0, 7IS 0. 005. FeSOi 7】S 0.001,CaCQ,0. GQ2 ,醯胺素500 ppm,核黄素25。ppm,肌醇ppm,泛酸5&0田血 对觐基苯酸5DO ppp , 生物案500 ppm,维生素&5Q0 ppn,泛酸500 叩t,烟政500叫m,琼脂2,陈海水74 蒸

12、慎 未曝 pH:7,2-7. 4可溶性淀粉0,25,景白睡0.酵母粉。05廿油磷酸一.钠0.01,琉脂幻陈海水7S蒸慌水PH7, 2-7.4菊萄槽L0,蛋白豚0一虱MP0. L0tM纯7EW0.05,琼脂 L pH:T.卜7.4可溶性淀粉L 黄豆粉抽提物1,5,醇母耕【).S, CaCO, 0.4,陈海水75,蒸懦水 23. pM:7. 2-7.4O) HV的配制：称取腐植酸，加1%的11CL,煮沸后过滤取上清各村雄生素与培养基其 他成分开灭菌.倒皿前加入=以上培养基除GA要求11510下.无菌30 min外，其余培养基询是1幻1C,火曲 21 mirio加入750 ppm放线菌酮的YE、SC

13、、GA. HV用于涂布预姓理后的样品；加入100 DM1重铝酸抑的YE.Gause用于重倍酸钾选择法，不加任何抑制剂戒抗生素的YE、5C、GL HV作为对照.不加任何抑制剂或抗生素的YE斜面用来保藏放或菌和真菌.2.22.1分离培养基M16E培养基：Yeast extract1gPeptone5gFePO40.1gAgar2%陈海水配制1000 mLISP3培养基：Oatmeal20 gTrace salt solution1 mLAgar2%蒸德水lOOOmLpH7.2Trace st solution：FeSO7H2O0.1gMnCl2.4H2O01 gZnSO7H2O0.1g去离子水10

14、0 mL察氏培养基；NaNO32gKjHPO*1gKCl0-5 gMgSOq0.5 gFcSOj0.01g庶糖30 EAgar2%蒸悔水1000 mLPH7.2GYM培养基；Glucose4gYeast extractMalt extract10 gAgar2%蒸悔水1000 mLpH7.2儿丁质培养基：K2HPO40.5 gMgSOQH?。02 gFeSO4-7H2O0.01gGlucose（大菌后加入）Wg凡丁质imAgar2%蒸播水lOOOinLpH72HV培养基：腐植酸1 gNa:HPO40火KC1L7gFeSOTHO10 mgMgSO4.7H2O20 gCaO2002 g核黄素0.5

15、 mg肌醇0.5 mg对氨基苯甲酸0.5 mg生物素0.25 mg烟酸0.5 mg泛酸0.5 mg雄生素B60,5 mg硫膑素0-5 mgAgar2%蒸ts水1000 mLpH7.22-2.22纯化培养基高氏号培券基；可溶性淀粉20g0.5 gMgSOqH 出0.5 gNaCl0.5 gNaNO31.0 gF?SOjtwig瑜脂2%蒸慵水1000 mLPH7.22.223发酵培养基TSB培养基（上海中科昆虫生物技术开发有限公司），胰蛋白豚17.0 g大豆蛋白臆3%NaCl5.0 g请萄糖2.5 gKH2PO42.5 蒸帽水1000 mL消前 pH 7.0-72发酵培养基可溶性淀粉20 黄豆饼粉

16、施葡萄新5g酵母提取物Z5gCaCChs gNaCI5g蒸馅水1000 mL叫7+2& 2-4培养基Table 2-4 Culture medium名称配方HL1培养基将 SJ.Cig fl孕毋氮源 YeastNihogenBase, Difco :- lOOmg Hr 2H I I . 物(Casainiiio acidh Difcn )溶于IL蒸爆水中r过滤除菌再向该溶 辕中加入无圈的崎酸氢二押溶娥.| T:：I： ： 121 U . 20iuin) | A IOOiuL 1.述璃木：宵鬲叫 1 可HL2培养基简痢勒1口&蛋白腾5声 期蛋E曲追 Nacl5g.琼20g. lOOOiuL蒸懈水