叶绿素分解代谢中叶绿素酶作为限速酶进行翻译后调节

1、The Plant Cell, Vol. 19: 1007 -022, March 2007, HYPERLINK a 2007 American Society of Plant BiologistsChlorophyllase Is a Rate-Limiting Enzyme inChlorophyll Catabolism and Is PosttranslationallyRegulatedSmadar Harpaz-Saad,a,b Tamar Azoulay,a,bTzahi Arazi,a Eran Ben-Yaakov,a,b Anahit Mett,a Yoel M. Sh

2、iboleth,c Stefan Ho rtensteiner,d David Gidoni,a Amit Gal-On,c Eliezer E. Goldschmidt,band Yoram Eyala,1叶绿素酶是叶绿素分解代谢中的限速酶并受翻译后调节叶绿素在光合作用中捕获光能起到了重要的作用，但是叶绿素分解代谢中的限速步骤和 分解代谢中酶的调节机制还不清楚。为了研究叶绿素酶(chlase)叶绿素分解代谢途径中 第一个酶一一的作用和调节机制，我们在两个不同的植株系统中表达了柑橘(Citrus sinensis) 叶绿素酶的两个不同类型：前体叶绿素酶和成熟叶绿素酶：(1)南瓜(Cucurbi

3、tapepo)植株使 用的是病毒载体表达系统；(2)短暂转化烟草(Mcotiana tabacum)原生质体。全长柑橘叶绿 素酶的表达在原生质体中导致了非常有限的叶绿素分解，在整株植株中没有观察到叶片不同 的表型；而表达缺乏N端21个氨基酸的叶绿素酶(ChlaseA),类似于成熟蛋白，导致了在烟 草原生质体和南瓜叶片中大量的叶绿素分解。在低光照下生长的表达ChlaseA的南瓜叶片呈 现出显著的黄萎病表型，而在自然光下生长的此类南瓜叶片出现了拟光损伤表型，证明了叶 绿素酸酯的积累，光中毒叶绿素分解产物。全长和成熟类型的柑橘叶绿素酶定位于表达的烟 草原生质体叶绿体膜组份上，并在此处对N端21个氨基

4、酸的加工。在两个植株系统我们都 证实了叶绿素酶在叶绿素分解代谢中作为限速酶，并且受翻译后调节。刖言叶绿素分子在光合作用中收集光能起到了重要的作用。它作为多聚蛋白色素光合复合物 的一部份发挥其功能，叶绿素捕获一个光子是转换光能成为化学能再储存为碳同化物的第一 步。因为叶绿素的生物合成和分解始终贯穿植株发育，这两条途径都受到可严重损害植株组 织的中间代谢组分的影响。但是，对于植株组织中叶绿素分解代谢调节的研究还不深入；特 别是对于叶绿素分级代谢中酶的调节机制还相当不清楚(Krautler and Matile, 1999; Hortensteiner, 2006)。叶绿素分解代谢主要发生在叶片衰老

5、和果实成熟期，但在自然周期内也以基础水平进行 (Goldschmidt, 2001)，受到环境条件影响导致光抑制，例如高光照(Prasil et al., 1992; Andersson and Barber, 1996)。在对植株组织中叶绿素分解产物的鉴定和描述后，叶绿素分解代谢途径 的研究最近取得了巨大的进展(Amir-Shapira et al., 1987; Engel et al., 1991; Matile et al., 1996; Ho rtensteiner, 1999)。叶绿素分解成为叶绿醇，镁和卟啉环初级剪切产物是由叶绿素酶 (Chlase)，Mg去螯合酶，脱镁叶绿素酸酯

6、加氧酶和红叶绿素分解代谢还原酶催化的连续四个 步骤实现的(图1)。失去叶绿素典型的绿色仅仅发生在脱镁叶绿素酸酯加氧酶催化的卟啉环 剪切后。接下来的步骤，卟啉环分解产物被加工运输到液泡中，可能它们被储存那里(Hortensteiner, 1999, 2004; Matile et al., 1999;Takamiya et al., 2000)。因此，叶绿素分解是一个 多步的酶催化过程，并且这里面包括的主要的酶在几年前已经被分离出来(Terpstra,1981;Trebitsh et al., 1993;Rodoni et al., 1997;Tsuchiya et al.,1997;Horte

7、nsteiner et al., 1998),这些酶 的基因迟迟未被克隆出来成为了研究叶绿素分解代谢的主要障碍(Takamiya et al., 2000)。近 几年分解代谢途径中关键酶基因得以分离(叶绿素酶Jacob-Wilk et al., 1999; Tsuchiya et al., 1999;红叶绿素分解代谢还原酶Wuthrich et al., 2000;脱镁叶绿素酸酯加氧酶Pru inska et al., 2003)为深入研究这些酶在叶绿素分解中的作用和调节作用提供了一个重要的工具。编码叶绿素酶的第一个基因是基于蛋白质序列资料(Jacob-Wilk et al., 1999; T

8、suchiya et al., 1999)从柑橘(Citrus sinensis)和藜属(Chenopodium)植物中分离出来的，并在成熟蛋白上发 现了N端编码序列的缺失。就两方面来说，这噪端的序列很短(在柑橘中仅有21个氨基酸， 而在藜属(Chenopodium)植物中仅有30个氨基酸)，并且这些N端序列没有叶绿体转运肽的特 点(藜属(Chenopodium)植物的序列更接近于内质网信号肽Takamiya et al., 2000)，有研究怀疑 是否所有的叶绿素酶都定位于叶绿体，进一步质疑是否有些叶绿素分解代谢在叶绿素整个分 子输出后可以发生在液泡内(Tsuchiya et al., 19

9、99;Takamiya et al., 2000)。柑橘中编码叶绿素酶 的基因(Jacob-Wilk et al., 1999)是唯一一个建立在叶绿体中分离纯化的酶克隆出来的基因。因 此，尽管包含短的(21个氨基酸)和非特异的N端序列，the experimental evidence places the encoded protein within the chloroplast (Trebitsh et al., 1993; Jacob-Wilk et al., 1999)。叶绿素分解代谢的调节和分解代谢中酶的调节机制的研究比较困难，并且存在大量争 议。叶绿素酶，分解代谢途径中的第一个酶

10、，看起来非常有可能是此途径中的限速酶(Tsuchiya et al., 1999)。实际上，一些资料也支持这个观点，例如脱绿和叶绿素酶在乙烯处理的柑橘中 诱导表达(Jacob-wilket al., 1999)。但是，也有其他文献不同意叶绿素酶在翻译水平上作为限 速酶进行调节的观点。(1)叶绿素酶在柑橘果实正常发育的整个过程中始终保持较低的组 成型表达，并且对于叶绿素分解产物与衰老和果实成熟的关系还不清楚(Jacob-Wilk et al., 1999)。(2)植株组织中叶绿素酶的活性，与体外分析一样，并不总是与自然衰老和果实成 熟过程中的脱绿相关(Minguez-Mosquera and G

11、allardo-Guerrero, 1996;Fang et al., 1998)。(3) 叶绿素酶被定位于叶绿体膜的内层(Brandis et al., 1996;Matile et al., 1997)，对于叶绿素酶与其 叶绿素底物如何接触还不清楚。因此，对于叶绿素分解代谢中叶绿素酶在自然周期、衰老和 脱绿过程中起到的调节作用和职责，综合这些资料我们可以看到两条主要的可能路线。一是 叶绿素是组成型表达的，在叶绿素分解代谢中不受调节。另外，资料同样支持叶绿素酶是限 速步骤，并且在翻译后调节。最近Benedetti and Arruda (2002)和Kariola et al. (2005)

12、的研究表 明，在拟南芥中过量表达叶绿素酶编码基因影响了叶片组织中叶绿素：叶绿素酸酯的比率， 但是没有获得可观察的表型。这些结果提供了拟南芥叶绿素酶基因产物在体外具备活性但是 没有在叶绿素酶调节中分流光，以及它在叶绿素分解代谢中的作用的实证。围绕叶绿素酶在叶绿素分解代谢中职责和调节作用的问题，我们开始在整株植物水平 和细胞水平表达不同类型的叶绿素酶基因进行生理学研究。我们得到的结果显示，过量表达 缺乏N端21个氨基酸的叶绿素酶类型，也就是成熟蛋白，导致了大量的叶绿素分解和萎黄 化，说明它通过非常规的机制进入了叶绿体，并且缺乏全长蛋白的调节抑制。在原生质体中 表达的全长和成熟柑橘叶绿素酶定位于叶绿

13、素膜，并在那里进行对N端21个氨基酸的加工。 我们认为，叶绿素在叶绿素分解代谢中起到限速酶的作用，并且受到翻译后调节的控制。Green colftfFigure 1. Chlorophyll Catabolic Pathway.结果Ser-147对于柑橘叶绿素酶的活性是必须的我们使用motif detection软件对Chlas基因的功能特征进行序列分析，发现了被公认为是 Ser脂肪酶结构域(Jacob-Wilk et al., 1999; Tsuchiya et al., 1999; Takamiya et al., 2000)。此Ser脂 肪酸结构域组成了Ser脂肪酸催化位点的核心，包括了

14、一个完整、保守、必须的Ser残基(Brady et al., 1990; Winkler et al., 1990; Blow, 1991; Lowe, 1992)。最近，Tsuchiya等人(2003)的研究表 明，Chenopodium album(灰菜)的叶绿素酶中相应的Ser残基对于酶在体内发挥功能是必须 的，为Ser脂肪酸结构域在叶绿素酶催化活性中的作用提供了试验上的支持。我们在柑橘叶 绿素酶基因中相应的Ser残基(密码子147)上诱导了 Ser到Thr的突变，并且对此重组酶在大 肠杆菌体内表达的功能进行分析，以在其他种属间的叶绿素酶建立普通适当的结果，并且开 发和建立植株试验的负对

15、照工具。野生型和S147T突变型的柑橘叶绿素酶都在大肠杆菌中以 成熟形式(ChlaseAN，缺少cDNA编码的前21个氨基酸)表达，也就是带有硫氧还蛋白的融 合蛋白，据报道重组的硫氧还蛋白融合蛋白具有较好的溶解性、稳定性和功能(Holmgren, 1985; LaVallie et al., 1992)。如前所述，可溶蛋白萃取物用以分析叶绿素酶体外的活性 (Jacob-Wilk et al., 1999)。结果显示，野生型重组酶(pTrx-ChlaseAN)具备活性，而S147T突变完 全失去了叶绿素酶体外活性(图2A)。在S147T重组突变内或者硫氧还蛋白(pTrx)对照内都没 有发现叶绿素

16、酸酯的积累。相应样品中可溶的硫氧还蛋白一叶绿素酶融合蛋白表达和硫氧还 蛋白对照(pTrx control)的一致性用硫氧还蛋白的单克隆抗体进行蛋白凝胶斑点分析得出(图 2B)。CnntI Jrxp lYx- pin-ChmwhN Ch Use ANSJ47TA EE 卜捋 Im aoueqJcUJqE12kD-Figure 2. In Vitro Enzyme Activity of Recombinant Chlase Versions.通过病毒载体系统在南瓜内过量表达柑橘叶绿素酶我们通过设计ZYMV-based病毒载体侵染克隆系统（AGII ）在南瓜内表达我们感兴趣的基 因，来分析Chla

17、se基因表达产物在植株体内的功能（Arazi et al., 2001, 2002; Shoresh et al., 2006）。病毒基因（包括感兴趣的基因）被翻译成多聚蛋白然后水解成合适大小的相等的病 毒蛋白。两种类型的柑橘Chlase基因被克隆进入AGII病毒载体多聚连接序列，位于Nib和coat 蛋白基因之间（图3A）：（1）全长叶绿素酶由完整的cDNA序列编码组成（AGII-Chlase）； （2） 相应的成熟蛋白类型（蛋白序列决定的Trebitsh et al., 1993），缺少由cDNA编码的前21个氨基 酸（AGII-ChlaseAN）0多聚连接体与NIa蛋白水解位点相连，以保

18、证感兴趣的外源基因产物将会 被NIa蛋白水解酶催化的蛋白剪切从多聚蛋白上释放出来（Arazi et al., 2001）。设计的两个克隆 的N端都在植株体内被加工成它们精确的原始序列，但是在:端保留了另外的6个氨基酸（加 工过后），保证NIa蛋白酶的识别。这个附加的。端序列确保在两个克隆上都有，应该对它们 的影响是一致的。我们分别用带有侵染力的AGII-Chlase克隆和AGII-ChlaseAN克隆颗粒轰击南瓜（Cucurbita pepo cv Maayan）子叶，以测试使用病毒系统在植株内不同类型Chlase基因的表达情况。取下 每个侵染植株的第三片真叶，在接种后8和21小时AGII基因

19、组中Chlase基因的稳定性用RT-PCR 进行进行测试（图3B）。试验获得了相应大小的RT-PCR产物：AGII病毒载体对照（476 bp）， AGII-Chlase（1463 bp），以及 AGII-ChlaseAN（1400 bp）。Chlase .DTVMLQ/MAA VDTVMLQ，ChlascAN -.DTVMLQ/ATLVKIOTVMLQ/S.L.Figure 3. Construction and Expression of a Viral Vector Containing the Citrus Chtasel Gene.低光照下培养的南瓜中过量表达ChlaseAN导致萎黄表

20、型对柑橘叶绿素酶在南瓜植株中过量表达产生的生理学效应的研究通过用各Chlas类型 的AGII病毒载体接种南瓜子叶来实现。接种后，将植株培养在温室中持续低光照15 RE）环 境下10天，监控第三片真叶（接种10天后完全展开）以观察表型。此试验每个组合至少有30 个植株的重复，典型的植株可以间后图。用空对照病毒载体（AGII）和编码全长叶绿素酶的载 体（AGII-Chlase）侵染的植株呈现正常的表型，并有非常轻微的病毒侵染的症状（图IA）。相对 的，用编码成熟蛋白对应的叶绿素酶载体（AGII-ChlaseAN）侵染的植株发展出了明显的斑点和 萎黄表型（图4A）。尽管获得了不同的表型，从表达两种类

21、型叶绿素酶（全长和ChlaseAN） 植株叶片的萃取物中叶绿素酶在体外的活性也进行了对比，测量出的结果显示，转化植株内 的叶绿素酶活性是AGII对照和未接种植株的400倍以上（图4B；数据未给出）。以AGII-Chlase 侵染的植株的叶绿素酶活性较以AGII-ChlaseAN侵染的植株高25%左右，与观察到的表型形成 对比。ChlaseAN过量表达植株的萎黄化表型与植物体内的叶绿素酶活性相关为了在ChlaseAN过量表达植株的萎黄化表型与叶绿素酶体内活性间建立联系，我们测试 了在南瓜植株中表达柑橘ChlaseAN S147T无活性突变体的生理学影响。侵染AGII-ChlaseAN的 植株再次

22、观察到了萎黄化的叶片表型，而在表达S147T突变体（ChlaseAN S147T）的植株上没有 观察到特殊表型（图4C）。病毒引起的重复和多聚蛋白翻译用RT-PCR和ZYMV coat蛋白抗体蛋 白凝胶斑点进行分析，以确认两种叶绿素酶类型的病毒载体都侵染了植株（数据未给出）。接下来对叶片发育期萎黄化表型的研究发现此表型具有明显的动力学模式。萎黄化表型 在第三片真叶时期开始出现，在叶片发育成熟期间发展直到侵染后10天左右（图5）。这10天以后，此表型开始消失，最后叶片复绿。4GJ l-ChhiieAGUAC Il-Cha ANAGII-ChlascAtrlt-CEiiLANA(Jl-：hlase

23、AA；IJ-ChlasciiSU7TL&L- 4君言ea号帽翌SVWJFig ure 5, Dynamics, of the Chlorotic FJhenotype in ChlaseiN-Expressing Plants.自然光照下培养的南瓜中过量表达Chlase削导致类光损伤表型过量表达全长叶绿素酶和ChlaseAN的生理学效应用培养在温室中暴露在自然光(500 rE) 下的植株进行测试。如前所述，此试验每个组合至少包括30株植株的重复，并且典型植株在 一下图片可见。虽然以AGII-Chlase或AGII对照侵染的植株再次没有特殊的表型，但是以AGII-ChlaseAN侵染的植株呈现出

24、明显的类光损伤表型（图6A）。此可致死的损伤，类似前人 报道的病原体导致的过敏性反应（Dangl et al., 1996），在叶片表面随处可见（图6A）。对叶片 自然萃取物测试的叶绿素酶体外活性显示，过量表达全长叶绿素酶或者ChlaseAN导致了叶绿 素酶活性较AGII侵染对照高200倍（图6B）。表达全长叶绿素酶的无特殊表型叶片的叶绿素 酶体外活性几乎是表达ChlaseAN呈现类光损伤表型的两倍。过量表达Chlase削植株的类光损伤表型属光依赖，且与叶绿素酶活性相关关于类光损伤表型和叶绿素酶活性间的联系的研究，通过测试过量表达和分析暴露在自 然光下的南瓜无活性的S147T突变植株实现。无活

25、性的突变表达植株（AGII-ChlaseAN S147T ）没 有出现ChlaseAN表达植株（AGII-ChlaseAN）所呈现的类光损伤表型，说明在此表型和叶绿素酶 活性间有直接的联系（图6C）。通过RT-PCR和使用ZYMV coat蛋白抗体的蛋白凝胶斑点分析 证实了两类型的叶绿素酶病毒载体的病毒的积累以及多聚蛋白翻译（数据未给出）。我们已经知道导致类光损伤表型有很多原因（Molina et al., 1999; Mittler and Rizhsky, 2000; Pruzinska et al., 2007），包括叶绿素生物合成中的光氧化剂压力和分解代谢突变（Hu et al., 1

26、998; Mock et al., 1999; Ishikawa et al., 2001; Pruzinska et al., 2007），直接测试表达ChlaseAN 植株类光损伤表型发展过程中包含的光很吸引人。以AGII- ChlaseAN侵染的植株培养在温室 中的自然光照条件下，每个处理第三片叶一半被遮去90%以上的光照。暴露的叶片部分发展 出了类光损伤的特征表型，而遮光的部分几乎没有此表型（图7A）。q.*t&一*。445些一AudoJa.u# BAGHACIKhlascAGHthl 雌 MN光中毒叶绿素分解产物的积累导致了类光损伤表型的出现前人研究表明，类光损伤表型可能是由于光中毒

27、叶绿素合成或分解产物积累导致的氧化 压力产生的（Hu et al., 1998; Mock et al., 1999; Ishikawa et al., 2001; Pruzinska et al., 2003, 2007）。因此，我们推测这种假设很有可能，表达ChlaseAN的南瓜植株产生的类光损伤表型 是由叶绿素分解产物积累导致增强了叶绿素酶功能引起的，然后导致下游酶催化反应的瓶 颈。实际上，在类光损伤表型出现前的2到3天，在生长期的表达ChlaseAN的南瓜植株叶片出 现了大量的叶绿素酸酯的积累（图7B）。这些叶片中叶绿素酸酯a :叶绿素a的比率较表达全 长叶绿素酶或者AGII病毒侵染或

28、未侵染的叶片的比率搞大约90倍。而叶绿素酸酯b :叶绿素b 的比率高了20倍。但是，在表达ChlaseAN植株中积累的叶绿素酸酯是短暂的，而且在光损伤 表型出现后其程度剧减（数据未给出）。我们发现不可能给此次实验进行叶绿素酸酯级别的 动力学研究，因为植株间处于不同发育期的叶片（3叶）差别很大。但是，试验结果非常具 有代表性，而且三个独立的实验都具备性质上的可重复行。Natural liightA ShadedFigure 7. Tte L&sen-Minic Premtjpe Casjsed ChfeLaeANIs Lght-Depends? and Ftesurts from IFe Acc

29、trnulation ofIIBreakcky Product.Nnn才i防侦由Chlcwophyil fhexans phase)Chlorcphyllidfi (acetone phase)在烟草原生质体中过量表达Chlase削导致叶绿素分解增强为了使得在南瓜植株中表达柑橘不同类型叶绿素酶产生生理学效应的研究更完善，我们 也分析了在烟草（Nicotiana tabacU原生质体中短暂表达柑橘叶绿素酶产生的影响（图8）。 因此，同样的柑橘不同叶绿素酶类型（全长和ChlaseAN）以细胞水平在附加的植株系统中得 以分析。设计的两个质粒包含由35S启动子引导的编码绿色荧光蛋白的基因（GFP），和

30、全长 Ch/ase（p35S-Chlase+35S-GFP）或 Ch/ase AV（p35S-ChlaseAN+35S-GFP）分别由附加的 35S 启动子引 导。另外还有一个对照质粒仅由35S启动子引导的GFP编码基因组成（p35S-GFP）。这三个质粒 通过electroporate进入烟草原生质体进行短暂转化，细胞荧光通过共焦显微镜记录（图8B）。 转化成功的细胞通过特异积聚在细胞质和细胞核中的GFP荧光可以筛选出来。转化细胞叶绿 体中的叶绿素级别由叶绿素红色自荧光进行监控。图8B展示了用7个独立实验总结的叶绿素 酶体内活性的半定量分析。通过红色荧光测定这三个组合的叶绿素级别显示典型的细

31、胞呈现 出相似的GFP荧光密度。只表达GFP的对照细胞的叶绿素级别通过测定得到叶绿素区域密度 （chlorophyll area intensity: CAI） = 15.55 1.8。过量表达全长叶绿素酶细胞叶绿体中的叶绿素 级别相对GFP对照呈现下降的趋势（23%; CAI = 3.6 0.5），说明体内有一些叶绿素分解活性的 存在，但是所有的叶绿体仍旧保留有意义的叶绿素数量（爵B）。过量表达:hlaseAN的细胞 呈现叶绿体缺乏叶绿素或者含有非常低水平的叶绿素（平均是野生型的4.5%； CAI = 0.71 0.64），说明体内的叶绿素分解活性得到增强。烟草原生质体中表达的叶绿素酶和Ch

32、lase削都定位于叶绿体膜表达叶绿素酶和ChlaseAN两种类型获得的不同表型使得我们去研究它们胞内定位。起初 的研究包括了可见的叶绿素酶-GFP和ChlaseAN-GFP融合体（N端、C端和内部融合）在烟草原 生质体中短暂地表达。但是，表达不同类型I的GFP融合体的原生质体都保持了正常的叶绿素 级别，说明发生了不正确定位或者失活。因此，我们选择另一条定位途径包括免疫探测表达 叶绿素酶或者ChlaseAN的原生质体叶绿体组份上的叶绿素酶不同类型（图8C,D）。烟草原生 质体中全长叶绿素酶表达最初以大约35KD的前体被发现，然后加工成为成熟形式的大约 33KD，而ChlaseAN表达形成的是成熟

33、形式（33KD）（图8C）。短暂转化表达叶绿素酶或ChlaseAN 72小时的烟草原生质体用于接下来对定位的研究（图8D）。柑橘叶绿素酶特异抗体免疫斑 点显示，全长和成熟叶绿素酶的可比级别呈现在Percoll梯度纯化的完整叶绿体相对于原生质 体中，而蛋白载入建立在相等的叶绿素上（叶绿素的降低发生在叶绿素表达原生质体中并不 重要，因为它们仅仅组成了 5%到10%的原生质体组分）。相似地，完全的ZhlaseAN级别在叶 绿体和原生质体中被发现，说明两种叶绿素酶类型都定位在叶绿体中。接下来的定位，通过冷冻/解冻循环（见方法）将完整的叶绿体裂解，以保证完整的叶 绿体溶解并且通过超速离心法处理为可溶组份

34、和膜组份。在表达全长的叶绿素原生质体中， 前体与成熟的叶绿素酶都能够在叶绿体膜组份中找到，而在可溶组份中都没有。用200mM 的NaCl缓冲液萃取膜组份中的膜结合叶绿素酶蛋白并未成功（数据未给出），而用0.5%Triton x-100缓冲液得到了这两种类型的叶绿素酶。原生质体中表达ChlaseAN得到了相似的结果， 在膜组份中发现了ChlaseAN，而在可溶组份中没有，而且用0.5%Triton x-100缓冲液使得蛋白 被释放。用内质网蛋白LHII （聚光复合物II）和OE33 （氧离析复合物的33KD亚基）的抗体做 探针探测膜以确认可溶组份与膜组份的分馏产物。完整的膜蛋白LHII仅在膜组份

35、中用0.5% Triton x-100缓冲液发现；相应的，在腔内以游离态和结合到类囊体镶嵌的光合系统II状态的 内腔蛋白O E33（Ettinger and Theg, 1991）,，用先前我们导致内囊提断裂并释放内腔蛋白的方 法，即猛烈的冰冻/解冻循环，在膜组份和可溶组份中都可以找到（Hincha et al., 1987;Grouneva et al., 2006）.。讨论本研究中，我们在两个不同的植物中用两个完全不同的表达系统，来研究叶绿素酶在叶 绿素分解代谢中的作用及其调节这一关键问题。虽然EST数据说明大多数植物都有不止一个 的叶绿素酶同源体，但是我们选择了柑橘Chlasel基因（J

36、acob-Wilk et al., 1999）来进行这项研 究，因为（1）这是唯一一个在试验上证明了编码定位于叶绿体膜上酶的叶绿素酶基因（Trebitsh et al., 1993; Jacob-Wilk et al., 1999）； （2）这是仅有的两个成熟蛋白加工位点在试验 上得以确定的叶绿素酶之一（Jacob-Wilk et al., 1999; Tsuchiya et al., 1999）。柑橘Chlasel基因在 两个系统中过量表达：（1）ZYMV-based病毒载体表达系统，有效地在南瓜植株中表达了两种 叶绿素酶至少21天，为研究叶绿素酶在植物中表达的生理学效应提供了充足的时间；(

37、2)在 烟草细胞中的短暂表达系统，得以在细胞水平观察柑橘叶绿素酶表达的生理学效应。在两个 系统中的试验结果都肯定与支持了我们以下的主要结论。我们得到的结果中最能激起兴趣的可能是ChlaseAN的表达，也就是相应的成熟柑橘叶绿 素酶，导致了原生质体与低光照下生长植株明显的萎黄化，而全长酶的表达仅导致了普通的 叶绿素分解。ChlaseAN明显失去了正常的调节功能，让我们想到了其他由于以下两个原因而 被活化的酶：(1)缺失调节结构域(例如：Glu脱羧酶缺失了钙调蛋白结合结构域Baum et al., 1996)；或者(2)缺失负责胞内酶定位的结构域(例如：HMGR缺失了膜结合结构域 Ayora-Ta

38、lavera et al., 2002)。因此，过量表达全长叶绿素酶获得的普通表型说明，与全长 HMGR和Glu脱羧酶类似，叶绿素酶是翻译后调节的。在低光照下生长的表达过量ChlaseAN的植株表现了萎黄化，而在自然光下表达相同结构 的植株表现了类光损伤表型，可能是由于氧化压力。我们证明了这个表型是由于光刺激导致 光反应叶绿素分解中间产物一一叶绿素酸酯短暂积累导致的。由光合作用器官外的叶绿素酸 酯吸收的光能，转化到单线态氧和氧自由基，引起了基因控制的程序化凋口Wagner et al., 2004)。在低光密度下，产生的胁迫和预期一样地降低，成功的反应了相应酶的机制。实际 上，在低光照环境下，

39、除叶绿素分解外没有其他任何损伤发生，并且萎黄化的叶片最终复绿 (图5)，大约发生病毒载体在全展开叶片中复制减少后，就像前人对马铃薯病毒的研究(Hull, 2002)。光和类光损伤中光中毒导致的叶绿素分解中间产物的相关性在接下来的研究中被没 有表型的半避光叶片(图7A)和已经报道的叶绿素合成代谢或分解代谢突变植株发生的相 似类光损伤表型事实证明(Hu et al., 1998; Mock et al., 1999; Molina et al., 1999; Ishikawa et al., 2001; Mach et al., 2001; Pruzinska et al., 2003)。这些结果

40、走到同一个观点，叶绿素分解代谢途 径是一个紧密控制、分解光中毒激活的色素必需的解毒过程(Vicentini et al., 1995; Matile et al., 1996; Ho rtensteiner, 2004; Yang et al., 2004)。本文中同样简要介绍了叶绿素酶分解途径，并 且重点介绍了叶绿素酶，其可能通过影响“损伤一生产”光中毒自由叶绿素级别来参与植物 的防御响应(Kariola ey al., 2005)。大量主要的核编码叶绿体蛋白通过包括N端信号肽的机制转移到叶绿体中，通过剪切进 入到叶绿体中(reviewed in Fuks and Schnell, 1997

41、)。基于这个原因，对于柑橘和藜属 (Chenopodium)核编码叶绿素酶成熟蛋白N端蛋白质序列的测定发现这些蛋白分解受到了21 位和30位的氨基酸加工(Trebitsh et al., 1993; Jacob-Wilk et al., 1999; Tsuchiya et al., 1999)。但 是，N端结构域剪切的作用还是个迷，因为这段序列不符合我们知道的任何叶绿素信号肽的 特点。基于现在已有的数据，我们认为柑橘叶绿素酶N端21个氨基酸结构域不起典型的N端 叶绿体引导信号肽的作用，因为全长叶绿素酶和ChlaseAN都进入了叶绿体并且催化了叶绿素 的分解。这个观点稍后被柑橘叶绿素酶N端结构域

42、没有引导GFP融合蛋白进入叶绿体的试验 印证(数据未给出)。所以，看起来有另外一个不同的蛋白结构域负责叶绿素酶向叶绿体中 输送，如同其他叶绿体内在囊膜蛋白(Miras et al., 2002)。本文中另外一个值得一提的是，叶 绿素酶可能是种糖蛋白(Terpstra, 1981; Tsuchiya et al., 1997, 1999)；因此，它进入叶绿体的通 道可能更复杂，可能通过糖基化进入，就像最近报道的碳脱水酶(Villarejo et al., 2005)。我们仅仅能在这一层面猜测，正常的调节叶绿素酶活性的机制是否知端21个氨基酸的 加工有关，并引起了叶绿素的降解。对于ChlaseAN

43、叶绿素分解活性增加可能的解释是切除了 包含在N端21个氨基酸中的调节结构域导致了植物体内更高的酶活性。这个可能让我们想起 了调节Ser脂肪酶催化位点的N端振动机制(Hermoso et al., 1996; Pignol et al., 2000)，尽管脂肪 酸的振动结构域是由底物遮盖起来的，并且不能被蛋白酶切除。另外一个可能是N端21个氨 基酸直接或简介参与了叶绿素酶区域化，N端的可切除给予了叶绿素酶直接接触底物叶绿素 酶的能力。这个可能性与定位芸苔和大麦(Hordeum vulgare)叶绿素酶于叶绿体内囊膜的研究 观点一致(Matile et al., 1997)。但是，这些试验中，仅有

44、6%的总细胞叶绿素酶活性在囊片段 上，可能是由于从叶绿体基质和基粒中分离叶绿体内囊膜技术上的困难。本文中需要提出的是，最近使用电子显微镜证明内囊和基质片层间有物理上的联系 (Shimoni et al., 2005)。因此，叶绿素酶定位在质体的内囊膜上是确定的(同样也在成色素细 胞的内质网上由Hirschfeld和Goldschmidt1983和Brandis等1996报道)，但是基于这里的资料 并没有排除定位于叶绿体膜的其他位置。关于不同植株种类叶绿素酶定位一致的唯一结果是 将叶绿素酶活性与叶绿体膜联系起来(Ardao and Vennesland, 1960; Terpstra, 1974

45、, 1976; Tarasenko et al., 1986; Trebitsh et al., 1993; Schellenberg and Matile, 1995)。为了进一步搞清楚叶绿素酶定位和叶绿素酶翻译后加工调节机制，我们通过在纯化的叶 绿体可溶和膜组份中表达可视的Chlase-GFP融合蛋白和免疫筛选两种叶绿素酶的方法在我 们的实验系统中定位柑橘叶绿素酶。Chlase-GFP融合蛋白显示是没有价值的，可能是因为错 误定位，对于使用GFP融合很常见(Tian et al., 2004)。叶绿体组份研究建立在Percoll梯度纯化 短暂表达的烟草原生质体叶绿体上，全长叶绿素酶和成熟叶

46、绿素酶都定位在叶绿体膜组份， 在那里也进行N端21个氨基酸的加工。介于叶绿素酶活性无论在幼嫩、衰老组织还是果实成 熟组织都集中在膜组份(Trebitsh et al., 1993),这个结果并不意外。虽然这些结果没有解开叶 绿素酶体内活性受翻译后调节的机制的问题，但是这过程的动力学说明了全长酶加工到成熟 形式可能是一个限速步骤。接下来的工作，可能使用电子显微镜，会回答是否不同的酶类型 定位于叶绿体中不同的膜部位，是否N端的加工与选择性的膜定位有关。本文中，我们注意 到膜区隔和叶绿体膜加工之间空间的再布置已经被证明是为了 D1蛋白的透过(Mattoo and Edelman, 1987)。叶绿素

47、酶作为叶绿素分解代谢中限速酶的可能的作用已经成为了争论的焦点，现有资料 没有下结论。叶绿素酶基因的表达和体内活性往往是组成型的，或者与自然的叶片衰老和果 实成熟没有联系(Minguez-Mosquera and Gallardo-Guerrero, 1996; Fang et al., 1998; Jacob-Wilk et al., 1999)，说明如果叶绿素酶不是叶绿素分解代谢中的限速酶就是叶绿素酶的功能受翻译 后调节，导致了功能上的迟缓(Matile et al., 1997, 1999; Jacob-Wilk et al., 1999)。本研究中， 我们使用缺少调节结构的叶绿素酶类型却

48、导致了彻底的萎黄化，说明叶绿素分解代谢中叶绿 素酶作为限速酶受翻译后调控。因为叶绿素的级别持续受到植物生命循环和分解途径的调 节，避免光中毒活性色素的积累，翻译后调节机制(相对于转录调节)使得生理正常化，使 得植株对于环境刺激的反应更加有效积极。这与转录调节机制并不矛盾；其实，在柑橘水果 中，乙烯能导致叶绿素酶基因的转录(Jacob-Wilk et al., 1999)。叶绿素酶与它的底物叶绿素接触并起始叶绿素分解的机制已经是一个有争议的问题，有 些文章中的观点认为可能叶绿素是朝着叶绿素酶移动并分解的机制，这样的叶绿素酶应该定 位于内囊膜上(Matile et al., 1997; Horte

49、nsteiner, 2006)。虽然我们现在没有任何资料证实这样 的机制，我们的结果显示ChlaseAN催化导致了严重的萎黄化，因此支持了叶绿素酶抵达富集 叶绿素的光合作用复合物的机制，且不能相反，如前所述。我们的结果关于体内和体外活性联系的问题在前面提到的生理学研究中叶绿素酶作用 的解释建立在其体外活性上。在南瓜叶片中表达全长柑橘叶绿素酶和ChlaseAN导致了由体外 分析得到的相似级别的叶绿素酶活性，但是极不同的表型。因此，结果说明对于体外叶绿素 酶活性的结果必须有极大的关注。虽然体外的活性可以证明大概的组织内叶绿素酶活性级 别，数据说明它并不能证明酶在体内真实的功能。这现象最可能的解释是

50、叶绿素酶功能受翻 译后调剂的观点;体外活性分析忽略了亚器官区隔化障碍的破坏或者直接对酶活性的影响导 致的正常功能的调节作用(例如：缓冲成分和去垢剂组份影响酶的活性)。这重要的一课对 于叶绿素酶功能和处于果实成熟和衰老发展期叶绿素分解调节间联系的研究可能非常实用。 相似地，叶绿素酶体外活性前人曾用做持绿突变叶绿素酶的研究(Akhtar et al., 1999)。今后的研究中，叶绿素酶翻译后调节机制可能会对持绿突变中的叶绿素酶和衰老和果实成熟中叶绿素分解代谢过程的研究有促进作用。IL CiuBSFaN TChh-sep35S-Chl5e+ 35S43FP35 kD瞬kDLHCIIOE33p35S

51、-ChlaEeAFJLHCli方法在细菌中表达重组的野生型和突变叶绿素酶包括了前21个氨基酸的叶绿素酶cDNA序列被克隆进入硫氧还蛋白融合表达载体pTrxFus (Invitrogen)，如前所述(Jacob-Wilk et al., 1999)。使用引物5-GCTGTTATGGGGCACACCCGCGG - AGGACAAACG-3 进行直接点突变产生叶绿素酶突变类型(Ser-1479Thr)。各类型叶绿素酶在大 肠杆菌中作为硫氧还融合蛋白表达(Jacob-Wilk et al., 1999)。可溶蛋白萃取物由10mL细菌细胞 4000g 10分钟离心得到。颗粒在2mLgrinding bu

52、ffer中重悬(20mM钠磷酸盐，pH8, 500mM NaCl, 0.1% Triton x-100)。加入1 mg/mL的溶酶体，悬液在4Cf孕育1小时后使用液氮开始三 个冰冻/解冻循环。样品在TC下15000g离心30分钟，分离可溶和颗粒组份。可溶叶绿素酶重 组蛋白体外活性分析如前人结论进行(Jacob-Wilk et al., 1999)。建立病毒载体AGII-Chlase质粒在南瓜中表达为了使得Chlase克隆进入AGII病毒载体(Arazi et al., 2001)，使用致变引物5-GTGGACGCC - AAGCCGGCAGCTTCAGTGC-3 和5-GCTACCCCAAGG

53、CCTTCAGCAAAATCTCCCAG-3在不改变编码 氨基酸的情况下通过直接点突变(Kunkel et al., 1987)去掉存在于原柑橘(Citrus sinensis)叶绿 素酶cDNA (位于76和426)的两个PstI限制性位点。全长(990bp开放阅读框)叶绿素酶基因 序列的两种类型(野生型和S147T突变型)使用包含PstI和SalI限制性位点的引物，以亚克隆 进入AGII病毒载体(5-GAACTGCAGATGGCAGCAATGGTGGACG-3和5-GATGTCGACTACTTTT- ACATGTGTTGTGGTAAGCATGCTTGATGC-3)。N端缺失(924bp开放

54、阅读框)的叶绿素酶基因 序列的两种类型(野生型和S147T突变型)使用包含PstI和SalI限制性位点的引物，以亚克隆 进入AGII病毒载体(5-CATTATCTGCAGGCCACACTTCCGGTATTTAC-3 和 5-GATGTCGACTACTTT- TACATGTGTTGTGGTAAGCATGCTTGATGC-3)。引物的设计包含了NIa蛋白水解位点(Arazi et al., 2001)和一个阅读片段与AGII基因一致，在3端没有任何密码停顿，使得叶绿素酶在植株体内 可以以病毒编码的多聚蛋白表达并在随后被NIa蛋白水解释放。叶绿素酶基因PCR扩增产物克 隆进入pGEM-T Easy质

55、粒(Promega)，测序，然后亚克隆进入AGII病毒载体。如前所述，阳性 克隆被用于接种南瓜植株(Cucurbita pepo)。南瓜植株生长、接种、症状评估本试验中全部使用商业上的栽培方法(cv Maayan)培养南瓜种子，当子叶全部展开时选 择幼苗进行试验。使用手枪装置(Gal-On et al., 1997)颗粒轰击以接种各个病毒载体。接种以 后，南瓜种子种植在生长室中23C下持续光照(11 rE)或者在温室中自然光照下(巧00 rE)。 每天观察症状发展，并对第一次出现症状进行了记录。通过Araz i等人(2001)的方法RT-PCR以 确认病毒在植株体内蔓延。叶绿素酶体外活性分析用

56、如前所述的方法(Jacob-Wilk et al., 1999)分析南瓜叶片粗萃取物中叶绿素酶的活性，做 了微小的改动：没有进行在反应液中的预培养，并且反应缓冲液由0.05mL的萃取缓冲液混成 (50mM磷酸钠盐，pH7.4， 50mM KCl，5mM MgCl2，5mM DTT和 1%Triton X-100)，0.45 mL 的反应缓冲液A (50 mM磷酸钠盐，pH 7.4和50mM KCl)，以及2.5mL的反应缓冲液B (50mM 磷酸钠盐，pH 7.4，50mM KCl和0.5% Triton X-100)。叶绿素酶a底物从欧芹(Petroselinum sativum)叶片中通过

57、Bazzaz和Rebeiz(1978)的方法制备，在-20C环境下干燥保存，用前用丙酮 重溶。南瓜叶片叶绿素：叶绿素酸酯比率的确定使用200 mg的切碎叶片在6 mL 100%丙酮4C黑暗中处理72小时萃取叶绿素。每个样品中 4毫升溶液加到含有6 mL己烷和1 mL KOH(10 mM)的透紫外线试管中。混合物混合均匀12000g 离心2分钟以获得分离的不同相。叶绿素级别在丙酮相中确定，而叶绿素酸酯级别在己烷相 中用分光光度法测得，使用Arnon(1949)的两公式表示Chla (Rg/mL)=12.7xA663 - 2.69xA645和 Chlb (Rg/mL)=22.9xA645 - 4.

58、68xA663。植株、原生质体、叶绿体和叶绿体组份中蛋白的萃取南瓜叶片组织样品(150 mg)在萃取缓冲液中均匀化，包含50 mM Tris-HCl，5%6-巯基乙 醇，10%甘油和2% SDS，pH 6.8，煮沸变性5分钟。萃取物以21000g离心10分钟，浮在表面 的转移到新的试管中，加入10%的甘油。相等体积的上浮物用SDS(12%)分离，如前所 述的用蛋白凝胶斑点分析。烟草(Nicotiana tabacU原生质体总蛋白使用欧冠USB蛋白萃取缓冲液萃取(20mM Tris-HCl，pH7.5，8 M尿素，4.5% SDS以及1 M 6-巯基乙醇)，用SDS分离，蛋白凝胶 斑点分析。制备叶绿体各组份，收集3.5X10源生质体用于转化各组合。原生质体在原生质 体溶解缓冲液中冰处理 30 分钟(50 mM HEPES, pH 8, 2 mM EDTA, 1 mM MgCl2,1 mM MnCl2, 0.33 M山梨醇，1 mM抗坏血酸