反硝化细菌项目说明书

1、一直位居世界第一。据统计，2004年我国水产养殖总产量达到3209万吨，占世界水产养殖产量的三分之二以上。但目前主要采用的集约化高密度养殖，如施肥给饵和密集轮养等养殖方式，会在养殖水体中积累大量的鱼类粪便、食物残渣和死亡的动植物尸体，导致水体氮素含量严重超标，富营养化情况严重，鱼虾病害频频发生，给水产养殖业尤其是高档精养池塘造成巨大损失。作为水体氮素存在形式之一的亚硝酸盐的控制一直是水产科学工作者研究的热点。这是因为它是水产动物致病的根源之一，其危害主要表现在它可以将鱼虾体内的亚铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，使其丧失运输氧的能力，从而造成鱼虾的窒息死亡。我国淡水渔业用水标准规定,养殖水质中的亚

2、硝酸盐氮应控制在0.2ppm以下，河蟹、对虾育苗水质的亚硝酸盐氮应控制在0.1ppm以下。本项目研究的生物修复技术是一种治污新模式，通过定向富集，从污水处理池活性污泥中筛选出TIN去除率较高的好氧反硝化细菌，并在实验室条件下，对该菌株在天然水体中的反硝化活性进行系统的研究，制作出可用于生物脱氮的微生态菌剂在废水处理方面,同步硝化反硝化相对于传统的生物脱氮工艺具有明显的优势。通过微生态制剂的直接投放，以及鱼类和水生植物的协同作用达到净水的目的。它具有高效、无二次污染，成本低、投资省，使用简单易操作等特点。本着消除污染，筛选高效去除水体富营养化的微生物菌剂，进而促进经济的可持续发展。利用活性污泥筛

3、选出TIN去除率较高的好氧反硝化细菌，不仅能减少工业废水对环境的污染，而且能充分利用资源，变废为宝，具有显著的环境效益。作品研究内容2.1研制目的本着充分利用资源、消除污染，制取可高效去除水体富营养化的微生物制剂，促进经济的可持续发展为目的。而从活性污泥中筛选好氧反硝化细菌。2.2实验材料和方法2.2.1实验主要仪器、料及试剂主要仪器:超净工作台（SWCJ-A），高压蒸汽灭菌锅，恒温培养箱（SPX-160型），摇床（HNY-200D），电子天平等。主要原料及试剂:BTB培养基（琼脂20g、KN031g、KH2PO41g、FeCI26H2O0.5g、CaCI27H2O0.2g、MgSO47H2O

4、1g、琥珀酸钠8.5g、溴百里酚蓝（BTB）（1%乙醇溶液）1mL,用1moI/L的NaOH调节pH至7.07.3,121C灭菌20min）,LB培养基（KNO31g、KH2PO41g、FeCI26H2OO.O5g、CaCI27H2OO.O2g、MgSO47H2O1g、琥珀酸钠8.5g,121C灭菌20min）。格里斯试剂A、B液，二苯胺试剂，其他试剂均分析纯。1.2.2取样南阳市污水处理厂曝气池中活性污泥；南阳师院十二里河污泥；南阳师院阳子湖湖水；南阳师院周围麦田土样2.2.3实验方法2.2.3.1.好氧反硝化细菌的初筛采用梯度稀释法将污泥样品稀释至适当浓度，取O.ImL均匀涂布于BTB培养

5、基表面，置入恒温培养箱，30工下培养23d后，用接种环挑取使周围培养基出现蓝色晕圈的单菌落，进行分离纯化即为初筛菌株。2.2.3.2.好氧反硝化细菌的复筛将初筛筛选出的好氧菌株接种到LB液体培养基的试管中，每支试管分装培养基的高度约为45cm,每株重复3管，在30C恒温下培养7d以上，每天观察其生长情况，检查试管是否混浊。并用格里斯(Griess)试剂检查培养液中是否已出现亚硝酸根。如果呈桃红或红色反应，说明硝酸盐已经在反硝化菌作用下生成亚硝酸盐，即为正反应。如为负反应，则就要检查培养液中是否还有硝酸根，即置白瓷板凹窝中加浓硫酸和二苯胺试液各2滴，然后滴入待测液12滴，如果有蓝色出现，说明有硝

6、酸根存在，即未进行反硝化作用，受检查管无反硝化细菌存在，如不出现蓝色，则说明硝酸根已完全消失，且作为硝化作用中间产物的亚硝酸根也完全消失，这证明受检查管的反硝化作用很强烈，有反硝化细菌存在，检查时应与空白对照，将检出具有反硝化作用的好氧菌作为复筛菌91，并将其接种于3号培养基的试管斜面，作为备用菌。2.3分析方法该方法是利用在培养液中滴加格里斯试剂、二苯胺试剂和奈氏试剂,通过显色反应指示亚硝态氮、硝态氮和氨态氮的变化31,从而筛选出对硝态氮有较强利用效果的菌株。在培养液中加入12滴格里斯试剂，以检测是否有亚硝酸盐的存在，如溶液立即呈粉红色或棕色等,则硝酸盐被还原成亚硝酸盐,说明该溶液中具有好氧

7、反硝化作用的细菌。如无红色出现,再加入二苯胺试剂,若培养液呈蓝色,则表示该培养液中硝酸盐未被转化,溶液中无反硝化细菌;若无色,则表示硝酸盐和刚生成的亚硝酸盐都已原成氮氧化物,说明该溶液中具有较强好氧反硝化功能的细菌。2.3菌株的分离与鉴定从十二里河的污泥中筛选到20株生长比较旺盛，反硝化能力较强的好氧反硝化细菌，分别接入含有硝酸钾的LB培养基中培养2-3d通过格里斯试剂检测菌株的反硝化速度，先有无色粉红色玫瑰红色棕色无色(滴入二苯胺仍为无色)先完成这个过程的细菌反消化能力较强，每隔12个小时检测一次，从中筛选8株菌做鉴定。菌株编号格里斯试剂检测结果12h后24h后36h后48h后1粉红色玫瑰红

8、色棕色无色2无色粉红色玫瑰红色棕色3粉红色玫瑰红色棕色无色4无色无色粉红色玫瑰红色5无色无色粉红色玫瑰红色6粉红色玫瑰红色棕色无色7无色粉红色玫瑰红色棕色8无色粉红色玫瑰红色棕色9粉红色玫瑰红色棕色无色10无色粉红色玫瑰红色棕色11粉红色玫瑰红色棕色无色12无色无色粉红色玫瑰红色13粉红色玫瑰红色棕色无色14无色粉红色玫瑰红色棕色15粉红色玫瑰红色棕色无色16无色粉红色玫瑰红色棕色17粉红色玫瑰红色棕色无色18无色粉红色玫瑰红色棕色19无色无色粉红色玫瑰红色20无色无色无色粉红色通过上表分析得1、3、6、9、11、13、15、17号菌株为反硝化能力强的优势菌株。将8株菌接种后第2天即产生大量气

9、泡,迅速降解亚硝态氮和总氮的菌株。6号菌株通过革兰氏染色法在显微镜下观察鉴定该菌株为革兰式阳性菌株，同时进行显微拍照观察该菌的外形为球形。2.4菌株反硝化特性静置培养条件下，菌株在接种后的3h进入了对数生长期，在10h菌体浓度达到最高，随后进入生长稳定期，在23h左右进入衰亡期。在对数生长期，由于培养基中含有丰富的营养物质，此时用于菌体增殖的氮源主要是培养基中的有机氮，而在生长稳定末期及衰亡期，菌体基本不再增殖，此时培养基中的亚硝态氮浓度的变化应该是由于反硝化作用引起的。反硝化碳源通常分为三种类型:第一类是易于生物降解的有机物,如实验中采用的甲醇、乙醇、蔗糖、葡萄糖等;第二类为可慢速生物降解的

10、有机物,如实验中的可溶性淀粉等;第三类为细胞物质,细菌会利用细胞成分进行内源反硝化。碳源的种类对菌株的反硝化活性有很大影响。一般来说，在反硝化过程中，易于生物降解的有机物是最好的电子供体，不仅反硝化速率快，还能够提高生物处理装置的能力和效率，使反硝化过程稳定可靠102.5反硝化碳源试验以LB培养基（KN031g、KH2PO41g、FeCI26H200.05g、CaCI27H200.02g、MgSO47H2O1g、蒸馏水1000ml、PH7.07.3为基础培养基，分别加入不同碳源柠檬酸钠10g、乙醇10g、醋酸钠10g、葡萄糖10g、可溶性淀粉10g、甲醇10g作为唯一碳源配制培养基。按1%接种

11、量接入活化并用无菌水洗涤干净的菌液，30弋静置培养60h后检测培养基中亚硝态氮的降解率。2.5.1.BTB平板筛选法该方法适用于对培养条件有特殊营养要求的某种好氧反硝化菌的定向筛选。运用此方法在好氧条件下，利用平板的抑菌圈大小，筛选到对不同碳源适应能力不同的20株好氧反硝化细菌菌株。2.6菌株在天然养殖水体中的反硝化特性取回的阳子湖水样经处理后,分为两部分，一份加入硝酸钾（氮源）和葡萄糖（碳源），分别取50ml分装于四个锥形瓶中，一组只加入硝酸钾，取50ml装入一个锥形瓶中，121弋,30口灭菌处理后，将不同浓度的菌种（1ml）接入锥形瓶中，28弋恒温培养。用格里斯试剂定时检测颜色变化。加N、

12、C只加N无C加N、C加N、C加N、C投菌浓度（个/L）检测时间（h）不投菌3x1073x1073x1083x10912h无色无色无色粉红色玫瑰红色16h无色无色无色玫瑰红色棕色20h24h30h36h2.7投菌浓度试验将不同浓度的菌种投入阳子湖水中，用格里斯试剂定时检测降解天然水中氮的速度。化作用,有必要从实际应用的可操作性出发,确定合适的投菌量。随着投菌量的增加，亚硝态氮的降解率逐渐升高；当投菌浓度达到108个/L时，菌株即可在水体中发挥高效的反硝化作用。说明该菌株具有较强的生存能力和环境适应能力，在天然水体中具有较强的竞争力。2产品性能分析生物脱氮以其无污染、脱氮彻底等优点被认为是目前最经

13、济、有效、可行性高的水体除氮方法。但由于种种原因,目前国内外市场尚无可有效治理水体亚硝态氮污染的微生态制剂产品。分离得到的微生物菌剂已在国内多个水塘进行了中试试验,均取得了良好的脱氮效果。加之芽孢杆菌具有很强的生命力和旺盛的繁殖能力，能适应各种不良的环境条件，受水体酸碱度、盐度等影响较小，因此该菌株具有开发成微生态制剂应用于受污染水体脱氮的巨大潜力。研制结论及应用本研究采用定向富集（反复筛选）的方法，从污水处理池活性污泥中筛选出IN去除率较高的好氧反硝化细菌。该方法操作简便、可行，反复筛选具有成本低、易操作、达标排放可靠性强且无二次污染等优点。具有较好的科学性和先进行。不仅降低了工业废水对水体

14、环境的危害，还可制得环保、高效去除水体富营养化的微生物菌剂，由此带来的环境效益和社会经济效益是非常显著的。该制备技术具有如下特：1方法操作简便、可行，反复筛选具有成本低、易操作、达标排放可靠性强且无二次污染等优点。2使硝化/反硝化反应在同一个反应器中进行，可以大大减少占地面积和建设资金3可以减少处理过程中加入调节系统pH值的化学物质，降低成本;好氧反硝化细菌在处理过程中更容易控制。42它的发现打破了反硝化只能在缺氧或厌氧条件下进行的传统观点,为新型生物脱氮提供了新思路.应用按本方法筛选到的好氧反硝化细菌市场潜力大，推广应用前景广阔，具有显著的经济效益我国每年用于环境污染投资约为830亿元，约占

15、当年GDP的1%。尽管如此，水环境污染趋势仍然没有得到有效控制，每年由于水质污染引起的损失共约为500亿元。同时，项目实施后可安排社会闲散人员就业，减轻就业压力，产生较好的社会效益。利用活性污泥筛选出TIN去除率较高的好氧反硝化细菌，不仅能减少工业废水对环境的污染，而且能充分利用资源，变废为宝，具有显著的环境效益。附录：BTB培养基平板初筛复筛过程中抑菌圈筛选的好氧反硝化菌斜面保存的形态特征图格里斯试剂染色后六号好氧反硝化菌株油镜下显微观察照片(10 x100)格里斯试剂的显色反应图示参考文献沈萍微生物学.MJJ匕京:高等教育出版社，2000,154翟茜,汪苹,李秀婷，等活性污泥中好氧反硝化菌的富集筛选及鉴别J环境科学与技术,2007,30(1):11-14国家环保局编委会水和废水监测分析方法(第3版)M.北京:中国环境科学出版社,1989黄运红，冯香玲,龙中儿，等好氧反硝化有效微生物群的筛选及特性研究J安徽农业科学,2007,35(36):11977-11979王弘宇，马放，苏俊峰，等不同碳源和碳氮比对一株好氧反硝化细菌脱氮性能的影响J.环境科学学报,2007,27(6):968-972李平,张山,刘德立.细菌好氧反硝化研究进展.微生物学杂志,2005,25(1):60-64.项慕飞,汪苹,李秀婷,等.废水脱氮系统中好氧反硝化菌的筛选与鉴定.食品科